Analisi del flusso metabolico ex vivo nei macrofagi splenici e cardiaci e nei monociti del midollo osseo

Riepilogo

Qui, descriviamo in dettaglio i metodi per estrarre i macrofagi dal midollo osseo, dalla milza e dal cuore infartuato e successivamente valutare il flusso metabolico nelle cellule vive.

Abstract

La riprogrammazione metabolica è un segno distintivo dell'attivazione di monociti/macrofagi e della polarizzazione tra stati pro e anti-infiammatori. Ad esempio, i monociti/macrofagi pro-infiammatori (cioè M1-like) mostrano una maggiore dipendenza dalla glicolisi anaerobica e una minore dipendenza dalla fosforilazione ossidativa mitocondriale, mentre i macrofagi antinfiammatori (M2-like) mostrano una maggiore dipendenza dal glucosio e dall'ossidazione degli acidi grassi nei mitocondri. Qui, descriviamo protocolli approfonditi per l'estrazione dei macrofagi dai due principali serbatoi di monociti/macrofagi nel corpo, la milza e il midollo osseo, nonché dai tessuti danneggiati come il cuore a seguito di infarto del miocardio.

I macrofagi o i monociti vengono estratti mediante selezione immunomagnetica utilizzando microsfere marcate con anticorpi, che si legano facilmente alle cellule senza comprometterne i fenotipi. Le cellule estratte vengono quindi coltivate in piastre a 96 pozzetti, seguite da un'analisi del flusso extracellulare utilizzando un analizzatore di flusso metabolico. Sia la glicolisi che la fosforilazione ossidativa mitocondriale possono essere misurate contemporaneamente in un piccolo numero di cellule (fino a 2-3 ×^10-5 cellule). Questo metodo può essere facilmente eseguito in 1 giorno e produce risultati affidabili e ripetibili. In definitiva, questi metodi aiutano a migliorare la nostra comprensione dei cambiamenti metabolici durante le risposte immunitarie e infiammatorie a lesioni e malattie, il che potrebbe portare allo sviluppo di nuovi bersagli terapeutici per le vie immunometaboliche.

Introduzione

L'immunometabolismo è un campo fiorente che studia il ruolo della riprogrammazione metabolica nelle cellule immunitarie in diversi stati patologici di malattia e lesione. I macrofagi sono una parte fondamentale del sistema immunitario innato che svolge un ruolo critico nell'infiammazione, nella risposta alle infezioni, nella presentazione dell'antigene e nella guarigione delle ferite¹. Comprendere come i macrofagi si polarizzano tra sottogruppi pro- e anti-infiammatori (M1-like e M2-like) in diversi stati patologici è un'area di indagine continua e intensa. Studi recenti hanno identificato la riprogrammazione metabolica come un meccanismo chiave alla base della polarizzazione dei macrofagi. Il paradigma attuale è che, in generale, i macrofagi simili a M1 (che sono tipicamente simili ai monociti) si affidano maggiormente alla glicolisi per alimentare le funzioni pro-infiammatorie, mentre i macrofagi simili a M2 si basano maggiormente sulla fosforilazione ossidativa mitocondriale per reprimere le funzioni pro-infiammatorie e alimentare i processi anti-infiammatori². Comprendere come il metabolismo dei macrofagi è alterato in diversi stati patologici può fornire informazioni su potenziali terapie che potrebbero essere utilizzate per colpire le vie metaboliche.

Ad esempio, il nostro laboratorio ha ampiamente studiato il ruolo della riprogrammazione metabolica dei macrofagi durante l'infarto del miocardio (MI)^3,4,5. I macrofagi svolgono un ruolo chiave nella risposta infiammatoria e di guarigione delle ferite durante l'infarto miocardico e, come tali, subiscono una polarizzazione da fenotipi M1-like a M2-like quando il cuore infartuato subisce un rimodellamento per formare tessuto cicatriziale sostitutivo. Utilizzando i metodi qui descritti, abbiamo dimostrato che questa polarizzazione è caratterizzata da cambiamenti unici nel metabolismo del glucosio e della glutammina e nella funzione mitocondriale. Descriviamo i metodi per l'estrazione dei macrofagi cardiaci, dei macrofagi splenici e dei monociti del midollo osseo, che possono essere combinati con l'analisi del flusso extracellulare per valutare il flusso metabolico ex vivo in un solo giorno. Ci auguriamo che i metodi descritti offrano un approccio standardizzato per valutare i fenotipi metabolici delle cellule immunitarie per migliorare la riproducibilità tra i laboratori che studiano questo importante argomento.

Protocollo

I metodi seguenti descrivono i protocolli per l'estrazione dei macrofagi e l'esecuzione di analisi ex vivo del flusso metabolico dal cuore infartuato in seguito all'infarto miocardico, alla milza e al midollo osseo (Figura 1). Per il cuore e la milza dell'infarto miocardico, il metodo di estrazione utilizzato è identico. Tutti i protocolli che coinvolgono i topi sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del Centro Medico dell'Università del Mississippi (Protocollo #1371, Mouton).

1. Estrazione di macrofagi dal cuore infartuato e dalla milza

NOTA: L'estrazione dei macrofagi tissutali utilizza una strategia di selezione negativa per rimuovere prima i neutrofili, che sono marcati con microsfere Ly6G, e poi una strategia di selezione positiva per ottenere macrofagi con microsfere CD11b 3,4,5,6. Quando si esegue questo protocollo, lavorare rapidamente e mantenere le celle fredde.

1. Eutanasia del topo in conformità con l'AALAC e le linee guida istituzionali mediante sovradosaggio di isoflurano seguito dalla rimozione del cuore.
2. Rimuovere rapidamente il cuore e la milza e pesare i tessuti.
3. Prima del test, preparare il tampone PEB sciogliendo l'EDTA (2 mM) e l'albumina sierica bovina allo 0,5% (p/v) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Mantenere freddo.
4. Metti il cuore nella soluzione salina bilanciata fredda di Hank (HBSS). Tritare con un bisturi sterile in piccoli pezzi.
5. Preparare una soluzione digestiva contenente 600 U/mL di collagenasi di tipo II e 60 U/mL di DNasi di tipo I. Mescolare il tessuto in 10 mL di soluzione di digestione in una provetta di dissociazione cellulare MACS.
   NOTA: Preparare una quantità sufficiente di soluzione digestiva per utilizzare 10 ml per ciascun fazzoletto (temperatura ambiente).
6. Incubare i tessuti utilizzando il dissociatore cellulare secondo il protocollo del produttore. Questo incuberà il tessuto tritato a 37 °C con una rotazione delicata per ~1 ora per generare una sospensione cellulare.
7. Spostare la sospensione in provette coniche da 15 mL e centrifugare a 300 × g per 10 minuti a 4 °C.
8. Risospendere il pellet in 1 mL di tampone PEB. Per generare una sospensione a cella singola, applicare la sospensione su un filtro da 30 μm.
9. Per lisare i globuli rossi, aggiungere 10 ml di soluzione 1x per lisi dei globuli rossi. Incubare per 5-10 minuti al buio a 4 °C.
10. Centrifugare la sospensione per 300 × g per 10 minuti a 4 °C.
11. Risospendere il pellet in 1 mL di PEB e contare le cellule utilizzando un ematocitometro.
12. Centrifugare la sospensione a 300 × g per 10 minuti a 4 °C.
13. Per rimuovere i neutrofili, preparare le microsfere mescolando 90 μL di tampone PEB con 10 μL di microsfere anti-Ly6G per^10-7 cellule. Mescolare il pellet cellulare con la sospensione di microsfere e incubare per 10 minuti al buio a 4 °C.
14. Per lavare le microsfere non legate, aggiungere 10 mL di tampone PEB e centrifugare a 300 × g per 10 minuti a 4 °C.
15. Preparare le colonne magnetiche (MS o LS) su un supporto magnetico. Bagnare le colonne aggiungendo 0,5-1,0 mL di tampone PEB.
    NOTA: Per i tessuti con un'abbondanza di cellule immunitarie (ad esempio, la milza), la colonna magnetica può facilmente ostruirsi e smettere di scorrere. Pertanto, si consiglia di utilizzare colonne LS per la milza.
16. Risospendere il pellet della cella in 500 μl di tampone PEB. Aggiungere la sospensione cellulare alla colonna magnetica e lasciare che le cellule non marcate (cioè non neutrofile) scorrano attraverso. Lavare la colonna 2 volte con 500 μL di tampone PEB. Raccogliere le cellule non marcate (cioè macrofagi e altre cellule) in una provetta conica da 15 mL.
17. Centrifugare la sospensione a 300 × g per 10 minuti a 4 °C.
18. Preparare le microsfere mescolando 90 μL di tampone PEB con 10 μL di microsfere anti-CD11b per 10⁷ cellule. Mescolare il pellet cellulare con la sospensione di microsfere e incubare per 15 minuti al buio a 4 °C.
19. Ripetere i passaggi 1.13-1.15.
20. I macrofagi marcati saranno legati alla colonna magnetica. Per raccoglierli, staccare la colonna magnetica dal supporto magnetico e posizionarla su una nuova provetta conica da 15 mL.
21. Aggiungere alla colonna 1 mL di terreno RPMI integrato con siero fetale bovino (FBS) allo 0,1%. Utilizzare lo stantuffo per estrarre i macrofagi nel tubo. Contare i macrofagi utilizzando un ematocitometro.
    NOTA: I macrofagi sono ora nella provetta e pronti per l'uso per ulteriori saggi.

2. Estrazione di monociti dal midollo osseo

NOTA: L'estrazione dei monociti dal midollo osseo utilizza una strategia di selezione negativa in cui i non monociti, inclusi i linfociti, le cellule natural killer, le cellule dendritiche, le cellule eritroidi e i granulociti (cioè i neutrofili), vengono marcati e rimossi immunomagneticamente.

1. Eutanasia del topo in conformità con l'AALAC e le linee guida istituzionali mediante sovradosaggio di isoflurano seguito dalla rimozione del cuore.
2. Rimuovi le gambe dal mouse. Nell'HBSS fredda, sezionare il muscolo lontano dalla tibia e dal femore fino a quando le ossa non sono pulite.
3. Taglia con cura entrambe le estremità dell'osso. Utilizzando una siringa da 10 ml con un ago da 27 G, sciacquare il midollo osseo in una provetta conica da 15 ml con tampone PEP. Centrifugare la sospensione a 300 × g per 10 minuti a 4 °C.
4. Eseguire i passaggi 1.8-1.12.
5. Aggiungere 175 μL di tampone PEP, 25 μL di reagente bloccante FcR e 50 μL di cocktail di biotina-anticorpi monocitari per 5 × 10⁷ di cellule totali. Incubare per 5 minuti al buio a 4 °C.
6. Lavare aggiungendo 10 mL di tampone PEB e centrifugare per 300 × g per 10 minuti a 4 °C.
7. Raccogliere il pellet e risospendere le cellule in 500 μL di tampone PEB e 100 μL di microsfere anti-Biotina. Incubare per 10 minuti al buio a 4 °C.
8. Preparare le colonne magnetiche (LS) su un supporto magnetico. Bagnare le colonne aggiungendo 1,0 mL di tampone PEB.
9. Applicare immediatamente la sospensione cellulare alla colonna. Utilizzare una provetta da 15 ml per raccogliere il flusso che contiene i monociti. I non monociti sono legati alla colonna magnetica.
10. Lavare la colonna 2 volte con 1 mL di tampone PEP. Contare i monociti utilizzando un ematocitometro.
11. Per preparare i monociti alla fase successiva, centrifugare a 300 × g per 10 min a 4 °C. Per l'analisi del flusso, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di RPMI + 0,1% FBS. Per la citometria a flusso, mantenere le cellule in PEB freddo e procedere con la colorazione.

3. Preparazione delle cellule per l'analisi del flusso metabolico

1. Idratare la cartuccia del sensore (il giorno prima del test)
   1. Rimuovere la cartuccia del sensore dalla confezione. Rimuovere la piastra del sensore (verde) dai pozzetti e pipettare 200 μl di liquido di calibrazione in ciascun pozzetto. Riposizionare la piastra del sensore sulla parte superiore della piastra della cartuccia in modo che i sensori siano immersi nel fluido di calibrazione.
   2. Immergere la cartuccia in un'incubatrice umidificata senza CO₂ (37 °C) per una notte.
2. Placcatura delle celle
   1. Piastra le cellule in una piastra di coltura a 96 pozzetti in 200 μL di terreno per almeno 1 ora. Lasciare almeno un pozzetto vuoto per le misurazioni di fondo (utilizzare lo stesso volume di terreno per i pozzetti vuoti).
      NOTA: Il numero ottimale di celle deve essere determinato prima della sperimentazione. Per ulteriori dettagli, vedere "Suggerimenti per la risoluzione dei problemi" nella discussione.
   2. Quando si è pronti per eseguire il saggio, preparare il terreno di flusso metabolico (ad esempio, RPMI basale o DMEM senza glucosio, glutammina, piruvato, ecc.). Per il test da sforzo della glicolisi, assicurarsi che il terreno basale sia integrato con 2 mM di glutammina. Per il test da sforzo mitocondriale, assicurarsi che il terreno basale sia integrato con 2 mM di glutammina, 10 mM di glucosio e 1 mM di piruvato.
   3. Sostituire con cura il vecchio terreno con un nuovo terreno basale pipettandolo lentamente (facendo attenzione a non rimuovere le cellule). Controlla le cellule al microscopio per assicurarti che siano ancora presenti.
   4. Porre la piastra cellulare in un incubatore umidificato non CO₂ (37 °C).
3. Caricamento della piastra di flusso
   1. Recuperare la cartuccia del sensore idratato/la piastra di flusso dall'incubatore.
   2. Preparare i composti in esame per la glicolisi o per il test da sforzo mitocondriale.
      1. Glicolisi: utilizzando i terreni basali della glicolisi, creare soluzioni madre sciogliendo il glucosio in 3 mL, l'oligomicina in 270 μL (100 μM) e il 2-desossiglucosio in 3 mL. Creare una soluzione di oligomicina funzionante di 10 μM.
      2. Mitocondriale: utilizzando terreni basali mitocondriali, creare soluzioni madre sciogliendo l'oligomicina in 630 μL (100 μM), il cianuro di carbonile-p-trifluorometossifenilidrazone (FCCP) in 720 μL (100 μM) e il rotenone/antimicina A in 540 μL (50 μM). Crea soluzioni funzionanti di oligomicina (0,5-2,5 μM), FCCP (0,125-2,0 μM) e rotenone/antimicina A (0,5 μM).
         NOTA: Abbiamo scoperto che 1,5 μM di oligomicina e 2,0 μM di FCCP producono i migliori risultati.
   3. Caricare i composti nelle porte utilizzando i seguenti volumi: porta A-20 μL, porta B-22 μL, porta C-25 μL, porta D-27 μL. Opzionale: caricare il farmaco o il composto di scelta nella porta A e testare i composti nelle porte B, C e D per valutare gli effetti acuti sulla glicolisi o sulla respirazione mitocondriale. Se non si utilizza un farmaco o un composto aggiuntivo, lasciare vuota la porta D.
4. Esecuzione del test
   1. Apri il software e seleziona Test da sforzo mitocondriale.
      NOTA: Questo programma può essere utilizzato anche per il test da sforzo della glicolisi, poiché viene misurato il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR).
   2. Seleziona i pozzetti che verranno utilizzati. Per sottrarre lo sfondo, assicurati che almeno 1 pozzetto non abbia celle.
   3. Esegui il programma. Caricare la piastra di flusso con il coperchio rimosso in modo che la piastra sia calibrata (~20 min).
   4. Dopo che la piastra è stata calibrata, il software visualizzerà una richiesta per caricare la piastra della cella. Estrarre la piastra cellulare dall'incubatore, rimuovere la parte inferiore della piastra di flusso e posizionare la piastra cellulare nel supporto. Premere Esegui. Il test richiederà ~2,5 ore per essere completato.
   5. Analizza i risultati utilizzando il software di flusso metabolico⁷ o un altro software analitico di tua scelta.

Risultati

Il numero tipico di cellule ottenuto dai diversi tessuti dipende dalle dimensioni, dall'età e dal sesso dell'animale. Per un topo maschio adulto (cioè di 16 settimane, ~30 g), la milza può produrre 3,0-4,0 × 10⁶ macrofagi, mentre il midollo osseo (due tibie e due femori) produce tipicamente 1,0-1,5 × 10⁶ monociti (Figura 2A). Anche il cuore infartuato in genere produce numeri elevati, a seconda del giorno dopo l'infarto miocardico<...

Discussione

Il nostro metodo descrive in dettaglio l'estrazione rapida di macrofagi dal midollo osseo, dalla milza e dal cuore infartuato, che possono quindi essere utilizzati per eseguire analisi a valle come l'analisi del flusso metabolico extracellulare. La combinazione di questi due metodi è un potente strumento in grado di quantificare i cambiamenti metabolici nei macrofagi in diversi stati di malattia o lesione, o stati metabolici come l'esercizio fisico. Mentre il nostro metodo si è concent...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD11b Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-126-725
Anti-Ly6G Microbeads UltraPure, mouse	Miltenyi Biotec	130-120-337
Collagenase type II	Worthington	NC9522060
Dnase type I	MillPore Sigma	11284932001
GentleMACS Octo Dissociator	Miltenyi Biotec	130-096-427
GentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	MACS cell dissociation tubes
Hank balanced salt solution	Fisher Scientific	14-025-076
LS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MS Magnetic Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Monocyte Isolation Kit Bone Marrow, mouse	Miltenyi Biotec	130-100-629	includes 1 mL of monocyte biotin-antibody cocktail, 2 mL of anti-biotin microbeads, 1 mL of FcR blocking reagent
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-108
Pre-separation filters (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-091-051
Red Blood Cell Lysis Solution (10x)	Miltenyi Biotec	130-094-183
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	103792-100	18 Pro sensor cartridges, 18 Pro Cell Cutlure Microplates, 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution
Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit	Agilent	103020-100	6 single-use pouches, each with glucose, oligomycin, and 2-deoxy-D-glucose
Seahorse XF Mitochondrial Stress Test Kit	Agilent	103015-100	6 single-use pouches, each with oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A
Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4, 500 mL	Agilent	103576-100	no phenol red, bicarbonate, glucose, pyruvate, or glutamine