فإن الكتاب أن نعترف Shelly شيه وباين جنيفر لمساعدتها التقنية للخبراء. وقدم هذا العمل ممكنا من خلال منح مقدمة من جمعية جراحة المسالك البولية للأطفال وأبحاث طب الأطفال الصندوق ستانفورد.

أولا إعداد القسطرات الإحليلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل الماوس المثانة والكلى لأخذ عينات ، ومكان 5-6 حبات الفولاذ المقاوم للصدأ (المثانة ، و 1.6 مم أو مزيج 0،9-2،0 ملم) او الخرز أكسيد الزركونيوم (الكلى ، وحجم 0.5 ملم) في أنبوب واحد cryovial ، على التوالي. الأوتوكلاف الأنابيب التي تحتوي على حبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أنابيب بارد لدرجة الحرارة المحيطة ، إضافة microliters من 200 برنامج تلفزيوني العقيمة على كل حبة غير القابل للصدأ الأنابيب التي تحتوي على الحديد و 400 microliters من برنامج تلفزيوني العقيمة على كل حبة الزركونيوم الانبوب المحتوية على أكسيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن نستعد إحليلي القسطرة كما وصفها المعلق وHultgren 13. الأوتوكلاف زوج نظيف من مسطح الرأس ملقط ومقص غرامة (القزحية أو نوع مشابه) والسماح للصكوك لتبرد لدرجة حرارة المحيط. مسح أسفل الأسطح لتدفق الصفحي هود مع الايثانول 70 ٪. في غطاء المحرك ، وقطع 30 سم (تقريبا) جزء من أنابيب البولي ايثيلين. المكان جو معقم و مطهر إبرة معقمة قياس 30 (إبرة طويلة 1 / 2 بوصة) على محقنة معقمة سم 3. التقط واحدة من نهاية قطع أنابيب البولي ايثيلين مع ملقط تعقيمها ، وحرك الأنبوب على الإبرة حتى يلتقي المحور. قطع الأنابيب بحيث حوالي 2 سم يمتد إلى أبعد من رأس الإبرة. إزالة القسطرة من المحاقن وضعها في طبق بتري معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحد من احتمالات التلوث المتبادل ، ونحن جعل واحدة لكل القسطرة الماوس. بعد أن يتم بذل كل القسطرة ، تعقيم التعرض لهم من قبل في طبق بتري كشفت اشعة فوق البنفسجية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة. لا تنظر مباشرة في مصابيح الأشعة فوق البنفسجية أو تعريض أي جزء من الجسم في حين يتم تنشيط غطاء المصابيح. بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، يمكن تخزين القسطرة على المدى الطويل في طبق بتري. نوصي ختم الطبق مع Parafilm للمساعدة في الحفاظ العقم. </li></ol> II. تلقيح الحيوانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن تصل الفئران على الأقل قبل أسبوع من التلاعب التجريبية بغية تجنب التوتر الناجم عن عوامل خارجية. وتستخدم الفئران الإناث لأن مجرى البول الماوس الذكور من الصعب للغاية يقثطر. CBA / J هي المستخدمة عادة ، التهاب المسالك البولية ، عرضة السلالة الفطرية الماوس. وينبغي أن تستخدم الفئران بين 8 و 12 أسبوعا من العمر ، لأن هذا هو الإطار من النضج المناعية قبل الشيخوخة. في اليوم الأول من التجربة ، وتراجع في نهاية حلقة عقيمة بتلقيح إلى قارورة من الأسهم البكتيرية المجمدة. كشط بإعداد قيحة الصغيرة والخروج متتالية على صفيحة آغار المناسبة. عموما ، uropathogenic E. يمكن زراعتها القولونية (UPEC) وغيرها من سلالات بين عشية وضحاها على آجار (LB) ، لوريا Bertani عند 37 درجة مئوية في الهواء المحيط. سلالات UPEC صلبة تنمو المستعمرات الأصفر والأبيض ، وشفافة على آجار LB. العودة فورا للسهم البكتيرية للمجمد. ويمكن للسلالات بكتيرية Uropathogenic تصبح أقل ضراوة مع مرور الوقت مع الثقافات وكرر التسلسلي. وبالتالي ، فإننا نوصي بها لوحة streaking آغار جديدة لكل تجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 2 من التجربة ، وبعد التأكد من مناسبة مورفولوجيا مستعمرة ، واختيار واحدة من لوحات المستعمرات آغار ومكان في لا يقل عن 5 سم مكعب من ثقافة مرق بين عشية وضحاها. ويمكن استخدام مرق LB عن سلالات بكتيرية أكثر uropathogenic (37 درجة مئوية ، 200 دورة في الدقيقة في الهواء المحيط). تبقي مباراة دولية فضفاضة على الأنابيب ثقافة مرق للسماح للتهوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 3 من التجربة ، وتأخذ 10 ٪ من حساء الثقافة أولا والثقافة في مرق بين عشية وضحاها مرة أخرى (عادة 37 دورة في الدقيقة و 200 درجة مئوية) ، لتعزيز النوع الأول الشعرة التعبير. مرق الثقافات المسلسل تساعد على تحسين uropathogenicity البكتيرية ، وقد ثبت منذ النوع الأول من الشعرة ليكون عاملا حاسما لuropathogens الفوعة في الجسم الحي 1. تبقي مباراة دولية فضفاضة على الأنابيب ثقافة مرق للسماح للتهوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 4 من التجربة ، وقياس OD 600 من ثقافة مرق من يوم 3. إن لم تكن معروفة من قبل لسلالة بكتيرية التي يجري اختبارها ، نفذ عشرة أضعاف تخفيف الطلاء على المسلسل لا يقل عن 7 سجلات (التخفيفات تنفيذها مع برنامج تلفزيوني ، والثقافات التي أجريت على آجار LB ، 37 درجة مئوية خلال الليل الحضانة) لتحديد العلاقة بين التطوير التنظيمي 600 و CFU / مل. كقاعدة عامة من الإبهام ، والتطوير التنظيمي 600 من 0،4-0،5 يتوافق عادة إلى 1 2x10 - 7 في 50 CFU microliters. مرة واحدة وقد تم تحديد العلاقة بين التطوير التنظيمي 600 و كفو / مل ، يمكن للمرء أن ضبط ثقافة مرق إلى 600 OD المقابلة لCFU المطلوب في الماوس في 50 microliters من برنامج تلفزيوني. وقد اقترح بعض الأعمال التي تلقيح 10 microliters ، بدلا من 50 ، ويؤدي إلى أقل الجزر في kidneys6. ومع ذلك ، فقد ذكرت معظم المنشورات استخدام 50 microliters في الماوس. عموما ، ويتراوح CFU المنشود بين 10 6 و 108 CFU / الماوس ، ولكن كل تركيبة سلالة بكتيرية / الماوس يحتاج إلى اختبار تجريبي في الجسم الحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للمساعدة على ضمان أن لا يفرغ قائح على الفور بعد تقطير ، ينبغي حرمان الفئران من الماء على الأقل 30 دقيقة قبل تحريض التخدير العام. آخر مناورة رئيسية هي للحث على يفرغ قبل تحريض التخدير قبل scruffing الفئران والضغط بلطف السفلي abdomأون. اثنين الى 2.5 ٪ isoflurane هو جرعة آمنة للتحريض 8-12 اسبوع الفئران CBA الإناث ، تليها التخدير الصيانة مع 1،8-2 ٪ isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متى تم تحقيق التخدير ، ويتم وضع الفئران في موقف ضعيف مع رؤوسهم تدرج في الرؤوس متصلة isoflurane المحتوية على الأوكسجين. يتم تدليك أسفل البطن لاجلاء البول من المثانة. إذا كانت المثانة فارغة نسبيا ، وهذا قد لا تسفر عن مناورة البول. هي غارقة في أسفل البطن والعجان مع الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويستخدم حقنة معقمة 1 سم بدون ابرة لوضع اللقاح المطلوب البكتيرية. المقبل ، يتم وضع قسطرة جو معقم و مطهر معقم الإحليل على حقنة. يتم قطع الأنبوب الزائدة قبالة القسطرة مع زوج من مقص بحيث 1-2 ملليمتر فقط من الأنابيب تبقى القاصي إلى رأس الإبرة. ثم ، يتم استغلالها في المحاقن والمكبس من الاكتئاب مع تستقيم حقنة لإزالة جميع الفقاعات. وجبة بوظة من جراثيم التشحيم هلام متدفق على طبق بتري معقمة أو داخل المجمع المحاقن المعقمة. وتراجع غيض من القسطرة (مع حقنة المرفقة) في الهلام. إذا كان يتم اختبار العديد من السلالات البكتيرية في التجربة نفسها ، يجب الحرص على عدم استخدام قطرة من نفس جيلي لتليين القسطرة التي تحتوي على سلالات مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر ستيريو (0.8x إلى مجموعة التكبير 5X) للتضخم ، يتم اغتنامها غطاء البظر بلطف من الفأرة تخدير في اليد غير المهيمن مع زوج من غرامة ملقط مسنن وأثار رأسيا لفضح العميق الصماخ الإحليل الوردي ( الشكل 1). واستوعب المحقنة (مع القسطرة المرفقة) في اليد المهيمنة مع قبضة قلم رصاص وتعمل غيض من قسطرة في مجرى البول الصماخ بزاوية 45 درجة. ويمتد غطاء البظر على طول المحور الطويل للحقنة ، على نحو فعال &quot;تحميل&quot; على مجرى البول القسطرة. هذه المناورة هو ضروري منذ الإحليل الماوس زائدة عن الحاجة. ينبغي أن تنزلق بسهولة قسطرة في المثانة (إلى المحور ، الشكل 2) ، ويمكن مدور بلطف للمساعدة في التنقل في طيات زائدة من مجرى البول. بمجرد hubbed القسطرة ، يمكن خفض حقنة حتى يتم بالتوازي مع محور طويل من الماوس. يمكن للجهة غير المهيمنة إسقاط ملقط للمساعدة في استقرار الوضع في القسطرة والمحاقن وجهة المهيمنة تستخدم لحقن اللقاح ببطء (لا يقل عن 5 ثوان). إذا رأيت السوائل المتدفقة حول القسطرة خلال الحقن ، وإما في المثانة ممتلئة أو القسطرة في المهبل (الذيلية لمجرد مجرى البول). وينبغي وقفها على الفور الحقن والقسطرة موقف درست بعناية. إذا كان القسطرة في مجرى البول ، يجب ألا تعطى الماوس يتم تضمينها في التجربة. من ناحية أخرى ، يمكن تعديل أوضاعها قسطرة في غير محله في المهبل ، وحاول إعادة الحقن. بعد الحقن ، ويتم سحب القسطرة ببطء والمحاقن من الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحد من احتمال يفرغ بعد التلقيح المبكر ، والتي قد تدار اجلاء البكتيريا ويؤدي بالتالي إلى مستويات العدوى متغير ، وبعض المحققين الحفاظ على الفئران تحت التخدير لمدة 30 دقيقة بعد inoculation10 عبر الاحليل. بعد الجراحة ، ويجب استرداد الفئران على بطانية الاحترار نظيفة مع المراقبة المستمرة لتأكيد عودة أنماط التنفس الطبيعي والنشاط. مرة واحدة الحيوانات تعافى تماما من القدرة على الزحف ، قد عادوا إلى الفراش المحتوية على الأقفاص. </li></ol> III. قياس CFU في الأنسجة المصابة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأفادت مختلف المنشورات UTI الماوس على النتائج ثقافة في الفترة من 6 ساعات لمدة أسبوع واحد أو أكثر آخر التلقيح. النقاط الوقت الأمثل يجب أن يتم تحديد تجريبيا لكل تركيبة سلالة بكتيرية / الماوس. يتم الحصول على البول للثقافة باطلة scruffing بواسطة الماوس فوق طبق بتري معقمة. يجب أن تبقى البول التي جمعت على الجليد في جميع الأوقات. قد محاولات عدة للحصول على البول على مدى عدة ساعات باطلة يكون ضروريا ، لأن يفرغ الماوس بشكل متكرر ، وحجم منخفض (3-10 microliters في الفراغ) ، والتي تعتمد على الضغط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحصول على عينات البول باطلة ، ونحن نضحي الفئران باستخدام خلع isoflurane وعنق الرحم. جو معقم و مطهر فتح البطن. إذا لم تكن عينة البول التي تم الحصول عليها بنجاح باطلة في وقت سابق ، ويمكن في كثير من الأحيان كمية صغيرة من البول يمكن أن يستنشق عبر جدار المثانة باستخدام إبرة قياس 30 و المحاقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم إزالة إحدى الكليتين أو كليهما ، المفروم إلى ما لا يقل عن 4 قطع (كل قطعة يجب أن تكون أقل من 50 ميكروغرام) على طبق بتري معقمة ، ووضعها في الزركونيوم حبة / PBS cryovials المحتوية على الجليد. يتم إزالة المثانة ، المفروم إلى ما لا يقل عن 4 قطع ، ووضعها في الفولاذ المقاوم للصدأ حبة / PBS cryovials المحتوية على الجليد. نسيج / حبة / PBS المحتوية cryovials يتم وضعها في خلاط رصاصة الخالط والمتجانس الأنسجة باستخدام &quot;8&quot; وضع السرعة لمدة دقيقة واحدة. ومن الشائع لبعض أجزاء الأنسجة لتبقى بعد التجانس. طالما يمكن pipetted 5-10 microliters جناسة من السائل ، وشظايا صلبةليست بالضرورة مشكلة. إذا زاد الوقت عن تجانس بعض العينات ، من المهم جدا أن تفعل ذلك بالنسبة لجميع الأنسجة من أجل الحفاظ على اتساق التجانس. نحن نستخدم رصاصة خلاط الخالط لأنه يتجنب احتمال التلوث المتبادل ، وأكثر سرعة من تجهيز العينات الفردية واحدة تلو الأخرى باستخدام الخالط القياسية ، وليس الحرارة بشكل كبير من العينات التي يجري المتجانس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي بذل ما لا يقل عن اثنين أو ثلاثة من عشرة أضعاف التخفيفات البول التي تم جمعها والنسيج الخليط في طبق microtiter. لإجراء التجارب الأولية قد يكون من الحكمة لجعل لا يقل عن سبعة عشرة أضعاف التخفيفات. ثقافة ما يصل الى 100 microliters البول والمثانة ، و / أو الكلى الخليط على أجار المناسبة. منذ البول العينات قد تكون محدودة الحجم ، قد يكون من الضروري جلب كميات ل100 microliters قبل تنفيذ عشرة أضعاف التخفيفات. إذا تطلب الأمر ذلك ، فإن التخفيف الأولي (قبل عشرة أضعاف تمييع) ضرورة أن يؤخذ في الاعتبار الحسابات النهائية للغلة البكتيرية. نحن نفضل UPEC على زراعة يوزين - الميثيلين الأزرق أو آغار ماكونكي (حضانة ليلا 37 درجة مئوية) ، لأن هذه وسائل الاعلام هي انتقائية للكائنات سلبية الغرام. سلالات UPEC تنمو على آغار ماكونكي كما مسرر مركزيا المستعمرات الأحمر الوردي ، وذلك بسبب قدرتها على تخمر اللاكتوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الثقافة بين عشية وضحاها ، عد CFU عن كل لوحة. لعينات المخفف متسلسل ، تعتبر لوحة تحتوي على تخفيف 5-10 المستعمرات العد الأكثر دقة. &quot;عودة&quot; حساب CFU في الأنسجة ، ولكل مليغرام من الأنسجة ، أو لكل مليلتر. </li></ol> رابعا. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الصماخ الإحليلي (النسيج وردي غامق) كشفها بواسطة رفع غطاء البظر رأسيا مع ملقط (خارج أعلى الصورة) <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. مقسطر مجرى البول. ويمكن رؤية مشقوق البظر فقط فوق القسطرة. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. CFU المثانة التهم 2 بعد أيام من العدوى عبر الاحليل من 8 اسابيع الفئران CBA / J أنثوية E. uropathogenic القولونية. وكانت متجانسة والعزم قربة كفو / مل بواسطة الطلاء تخفيف تسلسلي على آغار ماكونكي. الماس تشير كفو / مل الفئران الفردية ، شريط أفقي يشير متوسط ​​CFU / مل.

<ol>
	<li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice.">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li><li>Rouschop, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+CD44+facilitates+Escherichia+coli+infection+of+the+murine+urinary+tract.">Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract.</a> J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).</li><li>Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mast+cells+to+bacterial+clearance+and+their+proliferation+during+experimental+cystitis+induced+by+type+1+fimbriated+E.+coli.">Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli.</a> Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).</li><li>Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+flagella+is+coincident+with+uropathogenic+Escherichia+coli+ascension+to+the+upper+urinary+tract.">Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).</li><li>Hvidberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+long-term+ascending+urinary+tract+infection+mouse+model+for+antibiotic+treatment+studies.">Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).</li><li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli:+refining+the+murine+model.">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li><li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains.">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).</li><li>Gunther, N. W. t., Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+type+1+fimbria+regulation+in+uropathogenic+Escherichia+coli+during+experimental+urinary+tract+infection.">In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection.</a> Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).</li><li>Bishop, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP-regulated+exocytosis+of+Escherichia+coli+from+infected+bladder+epithelial+cells.">Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells.</a> Nat Med. 13, 625-630 (2007).</li><li>Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+responses+accelerate+bacterial+clearance+in+the+bladder.">Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder.</a> J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).</li><li>Hagberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending,+unobstructed+urinary+tract+infection+in+mice+caused+by+pyelonephritogenic+Escherichia+coli+of+human+origin.">Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin.</a> Infect Immun. 40, 273-283 (1983).</li><li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli:+refining+the+murine+model.">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تحريض البولية عدوى المسالك الماوس بواسطة التلقيح عبر الاحليل من البكتيريا هو إجراء المنشأة منذ فترة طويلة لكنه طالب تقنيا 11. وعلقت Hultgren نشرت مؤخرا استعراضا ممتازة من التقنيات عبر الاحليل العدوى الماوس المسالك البولية 13. في هذه الورقة ، ونحن نحاول توضيح م...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>640201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caps for cryovial tubes, with 'O' ring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>440011-N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bullet Blender</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Next Advance</td>
<td>BBX24</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zirconium Oxide Beads (0.5mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>ZROB05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Beads (1.6mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB14B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CBA/J Mice, 8-12 week old female</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Laboratories</td>
<td>000656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>1.10285.0500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (Aerrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>NDC 10019-773-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inoculating loops</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-363-601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eosin-methylene blue (EMB) agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Himedia Laboratories</td>
<td>MM022-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MacConkey agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>212123</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>427401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30 gauge needles, 1/2 inch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>305106</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml tuberculin Slip-Tip syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3 ml Luer-Lock syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309585</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transurethral induction of mouse urinary tract infection

تزرع سلالات بكتيرية Uropathogenic الفائدة على أجار. عموما ، uropathogenic<em&gt; E. القولونية</emيمكن زراعتها&gt; (UPEC) وغيرها من سلالات بين عشية وضحاها على لوريا ، Bertani (LB) أغار عند 37 درجة مئوية في الهواء المحيط. سلالات UPEC تنمو المستعمرات الأصفر والأبيض الشفاف على أجار LB. بعد تأكيد مورفولوجيا مستعمرة المناسبة ، ثم يتم اختيار واحد لتكون مستعمرات المستزرعة في المرق. ويمكن استخدام مرق LB لمعظم السلالات البكتيرية uropathogenic. ويمكن استخدام اثنين من المسلسل ، وبين عشية وضحاها مرق LB الثقافات لتعزيز التعبير عن النوع الأول من الشعرة ، وهذا عامل الفوعة واضحة المعالم للبكتيريا uropathogenic. مخففة الثقافات مرق للتركيز المطلوب في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). وضعت ثمانية إلى 12 أسبوع من العمر إناث الفئران تحت التخدير isoflurane وطعمت transurethrally مع البكتيريا باستخدام أنابيب البولي ايثيلين المغطاة قياس 30 المحاقن. قائح النموذجية ، التي يجب أن يتحدد تجريبيا لكل تركيبة سلالة بكتيرية / الماوس ، هي 10<sup&gt; 6</sup&gt; إلى 10<sup&gt; 8</sup&gt; CFU في الماوس في 10-50 microliters من برنامج تلفزيوني. بعد فترة العدوى المطلوب ويتم حصاد (يوم واحد لعدة أسابيع) ، وعينات البول والمثانة والكلى على حد سواء. غير مفروم كل جهاز ، وضعت في برنامج تلفزيوني ، والمتجانس في الخالط رصاصة الأزرق. مخففة متسلسل البول والانسجة الخليط في برنامج تلفزيوني ومثقف على أجار المناسبة. في اليوم التالي ، يتم حساب وحدات تشكيل مستعمرة.

Watch this Scientific Journal Video about Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection at JoVE.com

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

وهذا الفيديو شرح طرق للحث على transurethrally التهابات المسالك البولية والماوس تحديد مدى الإصابات الناجمة عن ذلك.

عبر الاحليل تحريض العدوى ماوس المسالك البولية

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

transurethral-induction-of-mouse-urinary-tract-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.5K Views.  Stanford University. وهذا الفيديو شرح طرق للحث على transurethrally التهابات المسالك البولية والماوس تحديد مدى الإصابات الناجمة عن ذلك.

Video: Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

إعداد مستمنع ماوس النخامية للتحريض التهاب النخامية الذاتية التجريبي

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

تحريض التهاب النخامية الذاتية التجريبية في الفئران SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

عزل الحمض النووي الريبي الزائفة الزنجارية استعمار الهضمي المسالك الفئران

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

عزل الخلايا اللمفاوية من المسالك التناسلية الماوس الغشاء المخاطي

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, which accurately reflect disease establishment and progression, permit dissection of host-pathogen interactions and generation of immunity to infection. In mice, intravesical instillation of uropathogenic E. coli, the causative agent in more than 85% of community acquired UTI, recapitulates many of the stages of infection observed in humans. Until recently, however, UTI could only be modeled in female animals. This limitation has hindered the study of sex-related differences in UTI, as well as other bladder pathologies, such as cancer. Here, we describe a method to instill male mice that allows direct comparison between female and male animals and provide a detailed protocol to assess bladder tissue by flow cytometry as a means to better understand host responses to infection. Together, these approaches will aid in the identification of host factors that contribute to sex biases observed in UTI and other bladder-associated diseases.

The established model of transurethral catheterization of mice allows the study of bladder pathologies, including urinary tract infection, but can only be performed in females. A new model of male transurethral instillation, presented here, will enable research in an area marked by strong clinical and epidemiological differences between the sexes.

عدوى المسالك البولية في نموذج حيوانات صغيرة: قسطرة Transurethral من الفئران الذكور والإناث

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

تحريض استجابة التهابية في الثقافات الابتدائية الكبدية من الفئران

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Transurethral Instillation Procedure in Adult Male Mouse

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into the urinary bladder to either induce animal models of bladder pathologies or evaluate the effectiveness of intravesical treatments. Most rodent models of lower urinary tract (LUT) pathologies are induced in female mice due to ease of intravesical instillation of the substances via the female urethra. However, due to anatomical differences between the female and male LUT, transurethral instillation in a male mouse has been deemed a very challenging procedure, and it has not been previously described. In this manuscript, we provide a detailed description of how to prepare polyethylene (PE) tubing for subsequent insertion into the urethra of a male mouse. In addition, we discuss the ideal types of PE tubing to be used depending on the desired site of inoculation. Furthermore, we describe point by point how to prepare an animal for a successful transurethral instillation to avoid injury to the urethra and ensure the delivery of the solution to the desired location. The procedure is started by retracting the prepuce and the glans to expose the opening of the urethral meatus. Next, the glans are grasped by blunt non-crushing forceps to stabilize the penis and the PE tubing. The PE tubing is first inserted into the urethral meatus parallel to the animal body, then its angle is adjusted by tilting the catheter to maneuver it to follow the natural curvature of the urethra. This technique can be used to induced murine models of bladder pathologies and/or evaluate the effectiveness of intravesical treatments in male mice.

Transurethral instillation is a challenging procedure and has not been well described in the literature. The aim of this manuscript is to describe a technique for transurethral insertion of a catheter for intravesical delivery of liquids with active substances into the urinary bladder and/or prostate in adult male mice.

تقطير ترانسوريثرال الداخلي في الماوس الذكور البالغين

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

نماذج الماوس الملوية العدوى وأمراض المعدة

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

عزل واحد المجتمعات البكتيرية داخل الخلايا التي تم إنشاؤها من نموذج موريني لعدوى المسالك البولية لتحليل خلية واحدة أسفل المجرى

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

تحريض إصابة الرئة الماوس عن طريق حقن الرغامى من بليموسين

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...