نشكر بامتنان T. Ragucci ، واتكينز B. ، S. ونغ ، وباء في Wallek Lynntech ، وشركة للحصول على المساعدة الفنية ومناقشات مفيدة كثيرة. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية الأميركية (NSF) في إطار منحة CBET - 0933688.

1. التصميم الأساسي للThermocycler حمل حراري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد شيدت لدينا جهاز بسيط يتكون من thermocycling الحمل الحراري للتبادل &quot;خراطيش&quot; رد فعل من البلاستيك الغرفة التي تقع بين صفائح الألمنيوم اللذين درجات حرارة يتم التحكم فيها بشكل مستقل 7 (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هي جزء لا يتجزأ الآبار مفاعل اسطواني بواسطة صفائف بالقطع من الثقوب في كتل البولي ، مع مجموعات مختلفة من القطر الثقب ورقة سمك البلاستيك المستخدمة لتحقيق نسب المطلوب (الطول / القطر = ح / د). تعتبر هندستها مفاعل اثنين مختلفة في النتائج المقدمة هنا : ح / د = 9 : ح = 15.9 ملم ، د = 1.75 مم ، 38،2 حجم ميكرولتر ؛ ح / د = 3 : ح = 6.02 ملم ، د = 1.98 مم ، 18.5 ميكرولتر وحدة التخزين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسخن السطح السفلي من المفاعل باستخدام كتلة الألومنيوم التي تحتوي على سخانات خرطوشة ربطه مع تحكم في درجة الحرارة microprocesser مدفوعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تنظيم درجة الحرارة على سطح المفاعل العلوي باستخدام كتلة الألومنيوم متصلة إعادة تدوير مياه الاستحمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يشد التجمع بأكمله معا باستخدام المسامير النايلون للحد من التوصيل الحراري بين الكتل المعارضة الألومنيوم. </li></ol> 2. إعداد والتحميل من خليط التفاعل PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نموذجي 100 ميكرولتر خليط التفاعل يحتوي على 10 ميكرولتر من محلول العازلة 10X ، 6 ميكرولتر من 25 ملم MgCl 2 ، 10 ميكرولتر من dNTPs (2 مم لكل منهما) ، 41.2 ميكرولتر من المياه DI ، 10 ميكرولتر من β - أكتين التحقيق ، و 10 ميكرولتر من β أكتين - التمهيدي إلى الأمام ، و 10 ميكرولتر من التمهيدي عكس β - أكتين ، 2 ميكرولتر من الحمض النووي البشري قالب الجينومية (10 نانوغرام / ميكرولتر) و 0.8 ميكرولتر من الحمض النووي بوليميريز KOD (2.5 وحدة / ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تحميل الكواشف ، وختم السطح السفلي من الغرفة PCR باستخدام ورقة رقيقة من الألومنيوم الشريط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الآبار مفاعل بمحلول 10 ملغ / مل من الزلال مائي المصل البقري تليها أمطار - X مكافحة الضباب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكواشف ماصة في آبار المفاعل باستخدام ماصة نصائح طويلة الجل التحميل وختم الشريط مع السطح العلوي تفلون FEP. </li></ol> 3. تشغيل الرد في Thermocycler حمل حراري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في رد الفعل ، وكتل الألومنيوم على حد سواء لتسخين درجات الحرارة المرغوبة السطح العلوي والسفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطيرة المفاعل بلاستيكية محملة PCR الكواشف بين الكتل التدفئة الألمنيوم ، ومشبك بسرعة التجمع معا باستخدام المسامير النايلون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد رد الفعل قد شرع في الوقت المطلوب ، وإيقاف سخانات ومكان خفض (الساخنة) سطح الجهاز على رأس كتلة معدنية مبردة لتبرد بسرعة وأنه وقف تدفق الحمل الحراري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مفاعل البلاستيك والمنتجات ماصة للخروج من الآبار (باستخدام تحميل طويلة الجل نصائح) لتحليلها لاحقا. </li></ol> 4. تحليل أداء جل الكهربائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 2 ٪ بالوزن agarose هلام عن طريق تسخين 10 غراما من agarose مع 500 مل من 1X العازلة على صفيحة ساخنة التحريك حتى يصبح الحل واضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل agarose هلام في درج الصب وإدراج المشط. السماح لمجموعة هلام 30 دقيقة ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المشط وإضافة 1X TAE العازلة حتى غمرت الجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fluorescently تحتوي على عينات من الحمض النووي الملون 2 ميكرولتر 100X SYBR الحل الأول الخضراء ، 2 ميكرولتر عينة من الحمض النووي ، 2 ميكرولتر تحميل صبغ برتقالي 6X ، و 4 العازلة تاي ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى عينات من الحمض النووي لتشغيل الآبار والانفصال في 60 V لل1 ساعة مع الحمض النووي غليان 100 علامة التحجيم سلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة صورة هلام وتحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية للحصول على النتيجة. </li></ol> 5. ممثل النتائج : التصميم الأمثل للthermocyclers الحمل الحراري ينطوي على اختيار هندسة المفاعل الصحيح من شأنها أن تولد تدفق الدورة الدموية قادرة على نقل الحرارة من خلال الكواشف الرئيسية المشاركة في عملية الاسترداد. معلمات الهندسية التي يمكن أن تختلف في المفاعلات اسطوانية نظر هنا هي ارتفاع (ح) وقطر (د) أو مكافئ نسبة الارتفاع (ح / د). لقد اكتشفنا حقول تدفق 3 - D الحمل الحراري داخل المفاعلات PCR على مجموعة من نسب مختلفة باستخدام ديناميات السوائل الحسابية (CFD) ، ووجد أن الأنماط المعقدة بشكل غير متوقع يمكن أن تنشأ. الأهم من ذلك ، فقد كشف تحليل لدينا مجموعة فرعية من هذه المجالات المعقدة التي تتدفق بشكل ملحوظ تسريع رد فعل 12. يمكن أن تكون هذه التأثيرات الهندسية اليها بوضوح من خلال المقارنة بين حقول التدفق في المفاعلات النووية في الجانب نسب العالية والمنخفضة. في حالة ارتفاع نسبة الجانب (ح / د = 9 ؛ طويل القامة ، نحيل أسطوانات) ، هي عناصر advected السوائل على طول مسارات تتبع المسارات التي هي خارج مقفلين الحلقات ، وأنها تخوض في لمتابعة مسارات نفسه لفترات طويلة من الوقت (3A الشكل). وبالتالي ، هناك فرصة ضئيلة للتبادل بين وانخفاض المسارات التي تعرض الكواشف للتسلسل الذي الأمثل لظروف حرارية لPCR (تتأرجح بين الصلب وتغيير طبيعة المتطرفة على السطوح المفاعل العلوي والسفلي) وفرقة أكبر بكثير من المسارات المتبقية التي لا تساهم في تضخيم (مترجم أقرب إلى مركز للمفاعل). مجال تدفق يختلف كثيرا في الجانب نسبة أصغر (ح / د = 3 ؛ أقصر وأوسع أسطوانات) ، لتصبح أكثر فوضوية بمعنى أن مسارات العنصر السائل لم تعد تتبع مسارات مغلقة (الشكل 3B). وبالتالي ، على الرغم من تعرض الكواشف إلى درجة الحرارة ملف أكثر تعقيدا ، وعناصر السائل قادرا على استكشاف طائفة أوسع بكثير من المسارات بحيث أن أكثر من حجم كاشف له الفرصة لتجربة التشكيلات الحراري الأمثل. هذه النتائج تشير إلى أنه في حين أن counterintuitively مسارات تدفق الفردية في ح / د = 9 قد يبدو أكثر ملاءمة لمحات عن طريق انتاج PCR درجة الحرارة التي &quot;تبدو&quot; مماثلة لتلك المستخدمة في thermocycler التقليدية ، والطبيعة الفوضوية للتدفق في مجال ح / د = 3 تسيطر في النهاية على نطاق عالمي من خلال تعزيز التبادل المعزز الكواشف بحيث لا تصبح المحاصرين في مسارات غير المواتية لفترة طويلة جدا. لاختبار هذه الفرضية وتحديد هندسة المفاعل كان أكثر ملاءمة للPCR ، استخدمنا كل منهما لتنفيذ النسخ المتماثل PCR من 295 هدفا غليان الجينات المرتبطة β - أكتين من قالب الحمض النووي الجينوم البشري. بشكل ملحوظ ، حققنا بشكل روتيني التضخيم للمنتج الهدف الصحيح في 10 دقيقة فقط في ح / د = 3 (الشكل 4A) ، في حين لوحظت نفس رد الفعل المطلوب على الأقل 20 دقيقة قبل اكتشافها في المنتجات ح / د = 9 (الشكل 4B) . خصوصية رد فعل هو أيضا أكبر بكثير في ح / د = 3 ، حيث يتم الحصول على منتج PCR واحدة ، بينما يتم إنشاؤها منتجات متعددة في وقت غير محدد ح / د = 9 حيث الفخاخ مجال تدفق السوائل في مسارات العناصر الحرارية السلبية لفترات طويلة من الزمن. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تمسك الحمل الحراري في غرفة اسطوانية الشكل الذي الأسطح العلوية والسفلية في درجات حرارة ثابتة مختلفة. إذا كانت درجة الحرارة على السطح السفلي هو أعلى مما كانت عليه في الجزء العلوي ، وإنشاء معامل الكثافة الرأسي داخل السائل المغلقة التي هي قادرة على توليد نمط تدفق الدورة الدموية. مع الاختيار الصحيح لمعلمات الهندسية (الارتفاع وح د القطر) ، يمكن تسخير هذا المجال لتحفيز تدفق الحمل الحراري PCR thermocycling عند manintained الأسطح العلوية والسفلية بالقرب من الصلب وتغيير طبيعة درجات الحرارة ، على التوالي (خطورة الأفعال الهبوط عموديا). <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 (أ) المكونات الرئيسية لتدفق PCR thermocyler الحمل الحراري. خرطوشة المفاعل يتكون من كتلة البولي يحتوي على مجموعة من غرف أسطوانية. وتأتي كتلة بين الصفيحة العلوية صممت لتكون متصلا حمام مائي تعميم وإدماج أسفل لوحة سخانات المضمنة. (ب) يتم تحميل PCR الكواشف ومختومة داخل المفاعل خرطوشة ، وبعد ذلك يتم تجميع الجهاز لتنفيذ رد فعل. عند الانتهاء ، يمكن procucts pipetted بسهولة لتحليلها لاحقا. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. المحاكاة الحاسوبية من 3 - D حقول تدفق الحمل الحراري المتولدة داخل مفاعلات أسطوانية مع درجات حرارة تتراوح بين 53 و 96 درجة مئوية المفروضة على الأسطح العلوية والسفلية ، على التوالي. وتظهر النتائج على نسب من (أ) ح / د = 9 (38.2 حجم المفاعل ميكرولتر) و (ب) ح / د = 3 (18.5 حجم المفاعل ميكرولتر). ويرد مسار ممثل تليها عنصر السائل السفر من خلال حقل تدفق 3D على يسار جنبا إلى جنب مع توقعات العرض من أعلى ، وجانب من الطريق ، ويظهر المؤامرة المقابلة لدرجات الحرارة مقابل الزمنية التالية عنصرا السوائل في اليمين. ملف الحرارية في 9 = ح / د تبدو قريبة لتلك التي من thermocycler التقليدية ، ولكن الفوضى في مجال تدفق 3 = ح / د هو أكثر ملاءمة للcounterintuitively PCR. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. نتائج تكرار الحمض النووي التي تم الحصول عليها في هندستها المفاعل هو مبين في الشكل 3 (العلوي والسفلي والحفاظ على السطوح في 53 و 96 درجة مئوية ، على التوالي). (أ) تسارع بشكل كبير في PCR 3 = ح / د ، كما يتضح من منتجات مرئية قوية بعد 10 دقيقة فقط من زمن التفاعل (M : 100 شركة بريتيش بتروليوم وسلم ، والممرات 1-4 : المنتجات من ردود فعل موازية في 4 غرف أسطوانية مختلفة). (ب </strاونج&gt;) ونفس رد الفعل المنجز في 9 = ح / د يتطلب على الأقل 20 دقيقة قبل أن يتم وحظ منتجات مرئية ، وشرائح متعددة واضحة تشير إلى النسخ المتماثل من الحمض النووي المستهدف غير محددة بالإضافة إلى المنتج المطلوب (M : 100 شركة بريتيش بتروليوم وسلم ، الممرات 1-2 : المنتجات من ردود فعل موازية في غرف 2 اسطوانية مختلفة).

<ol>
	<li>Spitzack, K. D., Ugaz, V. M., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Techniques:+Reviews+and+Protocols.">Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2005).</li><li>Krishnan, M., Ugaz, V. M., Burns, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+in+a+Rayleigh-B&#233;nard+convection+cell.">PCR in a Rayleigh-B&#233;nard convection cell.</a> Science. 298, 793-793 (2002).</li><li>Braun, D., Goddard, N. L., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exponential+DNA+replication+by+laminar+convection.">Exponential DNA replication by laminar convection.</a> Physical Review Letters. 91, 158103-158103 (2003).</li><li>Chen, Z., Qian, S., Abrams, W. R., Malamud, D., Bau, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermosiphon-based+PCR+reactor:+experiment+and+modeling.">Thermosiphon-based PCR reactor: experiment and modeling.</a> Analytical Chemistry. 76, 3707-3715 (2004).</li><li>Wheeler, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convectively+driven+polymerase+chain+reaction+thermal+cycler.">Convectively driven polymerase chain reaction thermal cycler.</a> Analytical Chemistry. 76, 4011-4016 (2004).</li><li>Krishnan, M., Agrawal, N., Burns, M. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+and+fluidics+in+miniaturized+natural+convection+systems.">Reactions and fluidics in miniaturized natural convection systems.</a> Analytical Chemistry. 76, 6254-6265 (2004).</li><li>Ugaz, V. M., Krishnan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+convective+flow+based+approaches+for+high-throughput+PCR+thermocycling.">Novel convective flow based approaches for high-throughput PCR thermocycling.</a> Journal of the Association for Laboratory Automation (JALA). 9, 318-323 (2004).</li><li>Yao, D. J., Chen, J. R., Ju, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-Rayleigh-Benard+convection+polymerase+chain+reaction+system.">Micro-Rayleigh-Benard convection polymerase chain reaction system.</a> Journal of Micro-Nanolithography MEMS and MOEMS. 6, 043007-043007 (2007).</li><li>Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pocket-sized+Convective+PCR+Thermocycler.">A Pocket-sized Convective PCR Thermocycler.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46, 4316-4319 (2007).</li><li>Yariv, E., Ben-Dov, G., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction+in+natural+convection+systems:+A+convection-diffusion-reaction+model.">Polymerase chain reaction in natural convection systems: A convection-diffusion-reaction model.</a> Europhysics Letters. 71, 1008-1014 (2005).</li><li>Allen, J. W., Kenward, M., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+flow+and+reaction+during+natural+convection+PCR.">Coupled flow and reaction during natural convection PCR.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 6, 121-130 (2009).</li><li>Muddu, R., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+Biochemistry+by+Chaotic+Stirring.">Accelerated Biochemistry by Chaotic Stirring.</a> , (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

لا يمكن للتفاعل بين التدفق والتفاعل الكيميائي تتغير بشكل كبير تحت تأثير التأفق الفوضى. لكن هذه الدول تدفق المعقدة تشكل تحديا للدراسة ، ولا سيما في هندستها واقعية حيث الآثار 3D تصبح مهمة. رايليغ - بينارد الحراري في ح / د&gt; 1 ليس فقط يوفر منصة ملائمة لاستكشاف هذه الظواهر ، وتطبيقها لتنفيذ PCR كما يمكن اقتران بين التفاعلات الكيميائية وتدفق للبحث. هذه القدرة الفريدة تجعل من الممكن لتحديد الدول التدفق الأمثل حيث الفوضى آثار الفعل (counterintuitively) لتسريع وتيرة تكرار الحمض النووي.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>KOD DNA Polymerase kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>71085-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TaqMan &beta;-actin Control Reagents kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>401846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axygen, Inc.</td>
<td>PCR-AS-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A2153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X Anti-Fog</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SOPUS Products</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Long Gel-loading Pipette Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-408-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FEP Teflon tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>7562A17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agarose gel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-3107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TAE running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>141-0743</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYBR Green I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
<td>S7563</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6x Orange Loading Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>R0631</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 bp DNA ladder sizing marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>170-8202</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rapid pcr thermocycling using microscale thermal convection

العديد من المقايسات البيولوجيا الجزيئية تعتمد في بعض الطريق على تفاعل البلمرة سلسلة (PCR) لتضخيم الحمض النووي المستهدف an تمييع البداية عينة لمستوى تركيز اكتشافها. إلا أن تصميم الأجهزة التقليدية thermocycling PCR ، ومقرها في الغالب على كتل ضخمة تسخين حرارة المعدن الذي ينظمه سخانات الحرارية ، يحد بشدة من تحقيق سرعة رد الفعل 1. مطلوب أيضا الطاقة الكهربائية الكبيرة للحرارة بشكل متكرر وتبريد خليط كاشف ، مما يحد من القدرة على نشر هذه الصكوك في شكل المحمولة. وقد برزت الحراري الحراري كنهج بديل thermocycling الواعدة التي لديها القدرة على التغلب على هذه القيود 2-9. التدفقات هي حدوث الحمل الحراري اليومية في مجموعة متنوعة من الإعدادات التي تتراوح بين الغلاف الجوي للأرض ، والمحيطات ، والداخلية ، والمصابيح الملونة والمزخرفة الحمم. وبدأت حركة السوائل في بنفس الطريقة في كل حالة : عدم استقرار الطفو مدفوعة تنشأ عندما يتعرض يقتصر حجم السائل إلى التدرج في درجة الحرارة المكانية. هذه الظواهر نفسها تقدم وسيلة جذابة لأداء thermocycling PCR. من خلال تطبيق التدرج في درجة الحرارة ثابتة عبر هندسة المفاعل صمم بشكل مناسب ، يمكن إنشاء تدفق الدورة الدموية المستمرة التي ستنقل PCR الكواشف مرارا عبر المناطق حرارة المرتبطة تغيير طبيعة ، الصلب ، ومراحل تمديد التفاعل (الشكل 1). ولذلك يمكن أن يفجرها Thermocycling بطريقة شبه متساوي من خلال عقد ببساطة سطحين معارضة في درجات حرارة ثابتة ، والقضاء تماما على الحاجة لتسخين وتبريد مرارا الصك. واحدة من التحديات الرئيسية التي تواجه تصميم thermocyclers الحمل الحراري هو الحاجة إلى التحكم بدقة في سرعة التوزيع المكاني ودرجة الحرارة داخل المفاعل لضمان أن تكون الكواشف احتلال المناطق بالتتابع درجة الحرارة الصحيحة لفترة كافية من الوقت 10،11. نحن هنا وصف نتائج الجهود التي نبذلها لتحقيق كامل 3 - D السرعة ودرجة الحرارة في التوزيعات الميكروسكيل thermocyclers الحملية 12. بشكل غير متوقع ، اكتشفنا مجموعة فرعية من مسارات تدفق المعقدة التي تبدو مواتية للغاية لPCR نتيجة لمزيج من التآزر (1) التبادل المستمر بين مسارات تدفق الذي يوفر فرصة لتعزيز الكواشف العينة إلى مجموعة كاملة من التشكيلات درجة الحرارة المثلى ، و ( 2) قضى وقتا في زيادة درجة حرارة المنطقة على تمديد معدل الحد خطوة من PCR. السريع للغاية مرات تضخيم الحمض النووي (تحت 10 دقيقة) قابلة للتحقيق في مفاعلات مصممة لتوليد هذه التدفقات.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection at JoVE.com

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

نحن تصف طريقة جديدة لإجراء النسخ المتماثل الحمض النووي عن طريق تفاعل البلمرة سلسلة (PCR). هو تسخير الحمل الحراري للمكوك الكواشف مستمر بين تغيير طبيعة ، الصلب ، وشروط التمديد من خلال الحفاظ على معارضة السطوح من المفاعل في درجة حرارة ثابتة. هذا التصميم البسيط لجعل الوعود بطبيعتها السريع PCR أكثر سهولة.

PCR Thermocycling السريع باستخدام الحراري الحرارية الميكروسكيل

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

rapid-pcr-thermocycling-using-microscale-thermal-convection

Research

JoVE Journal

Biology

22.6K Views.  Texas A&M University. نحن تصف طريقة جديدة لإجراء النسخ المتماثل الحمض النووي عن طريق تفاعل البلمرة سلسلة (PCR). هو تسخير الحمل الحراري للمكوك الكواشف مستمر بين تغيير طبيعة ، الصلب ، وشروط التمديد من خلال الحفاظ على معارضة السطوح من المفاعل في درجة حرارة ثابتة. هذا التصميم البسيط لجعل ا?...

Video: Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma&#039;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

التنميط الجيني السريع من الأنسجة باستخدام الماوس سيغما استخراج - N - PCR الأمبير الأنسجة كيت

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام PCR العلمية الحرارية سولاريس qPCR الفحص

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

متجانسة الكشف السريع عن طريق فحوصات البيولوجي المغناطيسي نظام Biosensing التحوير

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

من التنميط المسبق الجزئي الرناوات و microRNAs باستخدام الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) صالحة

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

تحديد ملامح التعبير الجيني في C. ايليجانس استخدام ميكروأري وPCR الوقت الحقيقي

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

PCR الأمثل القائم على الكشف عن المفطورة

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

سريعة وفعالة الزرد التنميط الجيني باستخدام PCR عالية الدقة مع تحليل نذوب

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to humans through the bite of infected Ixodes ticks. The primary etiological agent in North America is Borrelia burgdorferi sensu stricto. As geographic risk regions expand, it is prudent to support robust surveillance programs that can measure tick infection rates, and communicate findings to clinicians, veterinarians, and the general public. The molecular technique of nested polymerase chain reaction (nPCR) has long been used for this purpose, and it remains a central, inexpensive, and robust approach in the detection of Borrelia in both ticks and wildlife. 
This article demonstrates the application of nPCR to tick DNA extracts to identify infected specimens. Two independent B. burgdorferi targets, genes encoding Flagellin B (FlaB) and Outer surface protein A (OspA), have been used extensively with this technique. The protocol involves tick collection, DNA extraction, and then an initial round of PCR to detect each of the two Borrelia-specific loci. Subsequent polymerase chain reaction (PCR) uses the product of the first reaction as a new template to generate smaller, internal amplification fragments. The nested approach improves upon both the specificity and sensitivity of conventional PCR. A tick is considered positive for the pathogen when inner amplicons from both Borrelia genes can be detected by agarose gel electrophoresis.

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Nested PCR is a sensitive, specific, and straightforward technique that can be applied to tick DNA extracts to probe for Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme disease. The initial PCR experiment uses gene-specific primers to generate long amplicons, which then become templates for a subsequent reaction using internal primers.

الكشف عن مرض لايم Spirochete، البورليه Burgdorferi، في القراد باستخدام PCR متداخلة

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

دهن السريع الحبرية العزلة بروتوكول استخدام عدة عزل عضية الراسخة

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...