우리는 기꺼이 기술 지원 그리고 많은 도움이 토론에 대한 Lynntech 주식 회사에서 T. Ragucci, B. 왓킨스, S. 웡 및 B. Wallek 감사드립니다. 이 작품은 부여 CBET - 0,933,688 아래에있는 미국 국립 과학 재단 (NSF)에 의해 지원되었다.

1. 대류 Thermocycler의 기본 설계 <ol><li> 우리는 누구의 온도 독립적으로 (그림 2) 7 제어 두 알루미늄 플레이트 사이에 끼워 넣으면 아르 호환 플라스틱 반응 챔버 &quot;카트리지&quot;로 구성된 간단한 대류 thermocycling 장치를 건설했습니다. </li><li> 원통형 반응기 우물은 구멍 직경하고 원하는 가로 세로 비율 (높이 / 지름 = H / D) 달성을 채용 플라스틱 시트 두께의 다른 조합과 폴리 카보 네이트 블록의 구멍 가공 배열에 의해 포함됩니다. 두 가지 다른 원자로 형상은 여기 제시 결과에 간주됩니다 : H / D = 9 : H = 15.9 mm, D = 1.75 mm, 38.2 μL 볼륨, H / D = 3 : H = 6.02 mm, D = 1.98 mm, 18.5 μL 볼륨. </li><li> 반응기의 바닥 표면은 microprocesser 구동 온도 컨트롤러와 인터페이스 카트리지 히터를 포함하는 알루미늄 블록을 사용하여 가열합니다. </li><li> 반응기의 상단 표면에 온도는 순환 물을 욕조에 연결된 알루미늄 블록을 사용하는 규제이다. </li><li> 온 회중은 반대 알루미늄 블록 사이의 열전도를 제한하는 나일론 나사를 사용하여 서로 고정되어있다. </li></ol> 2. 준비 및 PCR 반응 혼합물의 로딩 <ol><li> 전형적인 100 μL 반응 혼합물은 10X 버퍼 용액, 25 MM 6 μL의 10 μL를 포함 MgCl 2, dNTPs 10 μL (2 MM 각), DI 물, β - 굴지 프로브 10 μL, β 10 μL의 41.2 μL - 굴지 앞으로의 뇌관, β - 굴지의 역방향 프라이머 10 μL, 인간 게놈 DNA 템플릿 (10 NG / μL) 2 μL 및 KOD DNA의 효소 (2.5 단위 / μL)의 0.8 μL. </li><li> 시약을 로딩하기 전에, 알루미늄 테이프 얇은 시트를 사용하여 PCR 챔버의 바닥 표면을 밀봉. </li><li> 비 - X 안티 - 안개 뒤에 소 혈청 알부민의 10 MG / ML 수용액으로 원자로 우물 린스. </li><li> 피펫 긴 젤 - 로딩 피펫 팁을 사용하여 반응기 우물에 시약 및 FEP 테플론 테이프 상부 표면을 밀봉. </li></ol> 3. 대류 Thermocycler의 반응을 실행 <ol><li> 원하는 위턱과 아래턱에 표면 온도에 대한 반응, 앞서 열을 가하다 알루미늄 블록을 모두 시작하기 전에. </li><li> 샌드위치는 플라스틱 원자로는 알루미늄 가열 블록 사이의 PCR 시약과 함께로드하고, 신속하게 나일론 나사를 사용하여 함께 어셈블​​리를 클램프. </li><li> 반응이 원하는 시간에 진행 후 히터를 끄고 급속하게 그것을 냉각하고 대류 흐름을 막을 차게 금속 블록의 상단에있는 장치의 낮은 (뜨거운) 표면을 놓으십시오. </li><li> 플라스틱 원자로를 제거하고 후속 분석을 위해 우물 (긴 겔 로딩 도움말을 사용)의 제품을 피펫. </li></ol> 4. 젤 전기 영동 분석을 수행 <ol><li> 솔루션은 분명해진다 때까지 감동 뜨거운 접시에 1X 버퍼 500 ML와 아가로 오스의 10g을 가열하여 2 % 아가로 오스 겔 WT를 준비합니다. </li><li> 캐스팅 트레이에 아가로 오스 겔을로드하고 빗를 삽입합니다. ~ 30 분 젤 세트를 보자. </li><li> 빗를 제거하고 젤이 변할 때까지 1X 태 버퍼를 추가합니다. </li><li> 찬란 스테인드 DNA 샘플 2 μL 100x SYBR 그린 I 솔루션, 2 μL DNA 샘플, 2 μL 배의 오렌지 로딩 염료, 4 μL 태 버퍼가 포함되어 있습니다. </li><li> 우물에 DNA 샘플을 추가하고 100 BP의 DNA 사다리 사이징 마커 1 H 60 V의 분리를 실행합니다. </li><li> 젤을 제거하고 결과를 얻기 위해 자외선 밑에 사진. </li></ol> 5. 대표 결과 : 대류 thermocyclers의 최적 설계 PCR 과정에 참여의 핵심 온도를 통해 시약을 수송 수있는 순환 흐름을 생성합니다 올바른 원자로 지오메 트리를 선택 포함됩니다. 여기에 고려 원통형 원자로에서 변경될 수있는 기하학적 매개 변수는 높이 (H)와 직경 (D), 또는 equivalently 비율 (H / D)입니다. 우리는 내부 전산 유체 역학 (CFD)을 사용하여 서로 다른 가로 세로 비율의 범위에서 PCR 반응 대류 3 - D 흐름 필드를 탐험하고, 예기치 않게 복잡한 패턴이 발생할 수 것으로 나타났습니다. 더 중요한 건, 우리의 분석은 크게 반응 12 가속 이러한 복잡한 유동 분야의 일부를 발견했습니다. 이러한 기하학적인 효과는 분명하게 높고 낮은 가로 세로 비율에서 반응기의 흐름 필드를 비교하여 볼 수 있습니다. 높은 비율의 경우에는 (H / D = 9; 키, 마른 체형의 실린더), 유체 요소는 기본적으로 루프를 폐쇄 경로를 추적 궤도를 따라 advected 있으며, 그들은 오랜 기간 동안 동일한 경로를 따라 잠겨있다 시간 (그림 3A). 따라서, F 사이의 교환을위한 약간의 기회가 있습니다PCR (어닐링과 반응의 상단 및 하단 표면에 극단을 denaturing 사이 진동)과 (중앙에 가까이화된 증폭에 기여하지 남은 궤도의 훨씬 더 큰 앙상블을위한 온도 조건을 최적의 순서에 시약을 노출 낮은 궤도 원자로의). 유체 요소의 탄도는 더 이상 닫힌 경로 (그림 3B)을 따라 그 의미에 더 혼란되고; 흐름 필드는 작은 비율 (짧고, 넓은 실린더 H / D = 3)에서 많은 차이가 있습니다. 따라서 시약은 더 복잡한 온도 프로파일의 대상에도 불구하고, 유체 요소는 시약 볼륨의 이상이 최적의 온도 프로파일을 경험할 수있는 기회를 가지고 있도록 궤도의 훨씬 넓은 범위를 탐험하실 수 있습니다. 이러한 결과는 counterintuitively H / D에서 동시에 각각의 흐름 궤도가 = 9 온도 프로파일을 제작하여 PCR에 대한 더 유리한 것으로 나타날 수 있습니다하는 것이 좋습니다되는 종래의 thermocycler / H에서 유동 분야의 혼란 자연 속에서 고용 비슷한 &quot;모양&quot; D = 3 궁극적으로 시약이 매우 오래 불리 궤도에 갇혀있다가하지 않도록 강화된 교류를 촉진하여 세계적인 규모로 역할을 하죠. 이 가설을 테스트하고 원자로 기하학은 PCR에 대한 더 유리한되었던 확인하려면, 우리는 인간 게놈의 DNA 템플릿에서 β - 굴지의 유전자와 관련된 295 BP 대상의 PCR 복제를 수행하는 둘 다를 사용합니다. 현저하게, 우리는 정기적으로 H에서만 10 분에 올바른 대상 제품의 증폭을 달성 / D 감지 제품 전에 최소한 20 분 필요 같은 반응은 H / D에서 관찰하는 동안 = 3 (그림 4A) = 9 (그림 4B) . 반응 특이성도 H에 훨씬 큰 / D = 3 어디서 여러 특이 현상이 제품은 H에 생성되는 동안 단일 PCR 제품이, 얻은 것입니다 / D = 9 어디 흐름 필드 트랩 오랜 기간 동안 불리한 열됐던 유체 요소. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 상단 및 하단 표면 원통형 챔버에서 열 대류는 다른 고정 온도에서 유지됩니다. 바닥 표면의 온도가 상단에보다 높은 경우, 수직 밀도 기울기는 순환 흐름 패턴을 생성할 수있는 동봉된 유체 내에 설립. 기하학적 매개 변수 (높이 H와 직경 D)의 올바른 선택을 통해 대류 흐름 필드가 위쪽과 아래쪽 표면이 각각 온도 (중력이 수직 하향 행위) 소둔 및 denaturing 근처 manintained 때 PCR의 thermocycling을 행동시키다을 무력화 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. (A) 대류 흐름의 주요 구성 요소가 PCR thermocyler. 원자로 카트리지는 원통형 챔버의 배열을 포함하는 폴리 카보 네이트 블록으로 구성되어 있습니다. 블록 순환 물 목욕 및 임베디드 히터를 통합 하단 플레이트에 연결하도록 설계된 최고의 접시 사이에 끼워 넣으면됩니다. (B) PCR의 시약은 장치가 반응을 수행하기 위해 조립하는 후, 로드된 및 원자로 카트리지 내부에 봉인하고 있습니다. 완료되면, procucts 쉽게 후속 분석을 위해 밖으로 pipetted 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 53과 96 온도와 원통형 반응기 내부에 생성되는 3 - D 대류 유동 분야의 전산 시뮬레이션 ° C 각각의 상단 및 하단 표면에 내려졌다. 결과의 가로 세로 비율에 표시됩니다 (A) H / D = 9 (38.2 μL 원자로 볼륨) 및 (b) H / D = 3 (18.5 μL 원자로 볼륨). 3D 흐름 필드를 통해 여행 유체 요소로 다음 대표 궤도가에 표시되는 경로의 - 상단과 측면보기 예측과 함께 왼쪽, 유체 요소에 다음과 같은 온도 대 시간의 해당 플롯은 오른쪽에 표시됩니다. H / D = 9시 온도 프로파일은 종래의 thermocycler의 가까이에 나타나지만, H / D = 3에서 혼돈 흐름 필드는 PCR에 대한 counterintuitively 더 유리한 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. DNA 복제 그림 3 (표면이 각각 53과 96 ° C로 유지되었다 상단과 하단)에 표시된 반응기 형상에서 얻어진 결과를. (A) PCR은 크게 반응 시간을 불과 10 분 (: 100 BP의 사다리, 차선 1-4 : 4 개의 원통형 실에서 병렬 반응의 제품 M) 이후에 보이는 강한 제품으로 분명, H / D = 3 가속됩니다. (B </str긴 사연이&gt;) (M 보이는 제품이 관찰되기 전에 H / D = 9시 공연 같은 반응은 적어도 20 분이되어 있어야하고, 여러 밴드가 원하는 제품 이외에 불특정 대상의 DNA 명백히 나타내는 복제 아르 : 100 BP 사다리, 레인스 1-2 : 2 다른 원통형 실에서 병렬 반응의 제품).

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

유동 및 화학 반응 사이의 상호 작용은 혼란 advection의 영향에 따라 크게 변경할 수 있습니다. 그러나 이러한 복잡한 흐름 상태는 특히 3D 효과가 중요 해지고 현실적인 형상에서 공부를 도전하고 있습니다. H에서 레일리 - 버나드의 대류 / D&gt; 1뿐만 아니라 이러한 현상을 탐험하는 편리한 플랫폼을 제공, PCR을 수행하기 위해 응용 프로그램은 또한 탐지하는 흐름과 화학 반응 사이의 커플링을 수 있습니다. 이 독특한 기능은 가능한 혼란 효과 행위 (counterintuitively) DNA 복제의 속도를 가속하기 위해 최적의 흐름 상태를 선택할 수 있습니다.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>KOD DNA Polymerase kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>71085-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TaqMan &beta;-actin Control Reagents kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>401846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axygen, Inc.</td>
<td>PCR-AS-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A2153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X Anti-Fog</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SOPUS Products</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Long Gel-loading Pipette Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-408-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FEP Teflon tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>7562A17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agarose gel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-3107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TAE running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>141-0743</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYBR Green I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
<td>S7563</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6x Orange Loading Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>R0631</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 bp DNA ladder sizing marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>170-8202</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rapid pcr thermocycling using microscale thermal convection

많은 분자 생물학의 assays가 감지 농도 수준에 초기 희석 대상의 DNA 샘플을 증폭하는 효소의 연쇄 반응 (PCR)에 어떤 식으로든 따라 달라집니다. 그러나 기존의 PCR의 thermocycling 하드웨어의 설계는 주로 그의 온도 열전 히터에 의해 규제되어 심각하게 달성 반응 속도 1 제한 대규모 금속 가열 블록을 기반으로. 상당한 전력 또한 휴대용 형식으로이 악기를 배포할 수있는 능력을 제한, 반복 열 및 시약 혼합물을 냉각이 필요합니다. 열 대류는 이러한 한계를 극복에게 2-9으로 잠재력을 가진 유망 대체 thermocycling 접근 방식으로 부상했다. 대류 흐름은 장식과 다채로운 용암 램프에 지구의 대기, 바다, 인테리어,에 이르기까지 설정의 다양한 배열에서 매일 발생하고 있습니다. 유체 운동은 각각의 경우에 같은 방법으로 시작됩니다 부력 중심 불안정 액체가 국한 볼륨 공간의 온도 기울기의 대상이되었을 때 발생합니다. 이 같은 현상은 PCR의 thermocycling을 수행하는 매력적인 방법을 제공합니다. 적절하게 설계된 원자로 기하학에 걸쳐 정적 온도 기울기를 적용함으로써, 지속적인 순환 흐름이 반복, denaturing 어닐링과 반응 (그림 1)의 확장 단계와 관련된 온도 영역을 통해 PCR 시약의 수송을 것입니다 설정할 수 있습니다. Thermocycling 따라서 완전히 반복 열 및 악기를 냉각하지 않아도, 간단하게 고정 온도에서 두 대립 표면을 개최하여 의사 등온 방식으로 actuated 수 있습니다. 대류 thermocyclers의 디자인을 직면하고있는 주요 과제 중 하나는 정확하게 시약은 순차적으로 시간 10,11의 충분한 기간 동안 정확한 온도 영역을 차지할 수 있도록 원자로 내의 공간 속도 및 온도 배포판을 제어하기 위해 필요합니다. 여기 microscale 대류 thermocyclers 12 전체 3 - D 속도 및 온도 배포판을 탐사하기위한 노력의 결과를 설명합니다. 예기치 않게, 우리는 시약 최적의 온도 프로파일의 전체 범위를 샘플 수있는 향상된 기회를 제공하는 흐름 경로 사이에 (1) 지속적인 교류의 시너지 조합에 의한 PCR을위한 매우 유리한 아르 복잡한 유동 궤도의 하위 집합을 발견하고, (이 2) 증가 시간은 PCR의 단계를 제한 확장 온도 영역 내에서 속도를 보냈다. 매우 빠른 DNA를 증폭 시간 (10 분 이하) 이러한 흐름을 생성하기위한 원자로에서 달성하고 있습니다.

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Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

우리는 효소의 연쇄 반응 (PCR)을 통해 DNA의 복제를 수행하는 소설 방법을 설명합니다. 열 대류는 일정한 온도에서 반응기의 표면에 반대 유지하여 denaturing 소둔 및 확장 조건 사이의 지속적인 셔틀 시약을 무력화합니다. 이것은 본질적으로 단순한 디자인은 신속한 PCR 더 접근할 수 있도록 약속드립니다.

Microscale 열 대류를 사용하여 신속한 PCR의 Thermocycling

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

rapid-pcr-thermocycling-using-microscale-thermal-convection

Research

JoVE Journal

Biology

22.6K 조회수.  Texas A&M University. 우리는 효소의 연쇄 반응 (PCR)을 통해 DNA의 복제를 수행하는 소설 방법을 설명합니다. 열 대류는 일정한 온도에서 반응기의 표면에 반대 유지하여 denaturing 소둔 및 확장 조건 사이의 지속적인 셔틀 시약을 무력화합니다. 이것은 본질적으로 단순한 디자인은 신속한 PCR 더 접근할 수 있도록 약속드립니다.

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Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma&#039;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

시그마의 압축을 풉니다 - N - 앰프 조직 PCR 키트를 사용하여 마우스 조직의 신속한 Genotyping

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

연구

생물학

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

써모 과학 솔라리스 qPCR 어세를 사용하여 정량 실시간 PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

자기 변조 Biosensing 시스템을 사용하여 생물 학적 Assays의 급속한 동차 검색

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

Mycoplasma의 최적화된 PCR 기반의 감지

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

미세 규모 Thermophoresis에 의한 결합력 결정 단백질 정제 - 무료 방법

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to humans through the bite of infected Ixodes ticks. The primary etiological agent in North America is Borrelia burgdorferi sensu stricto. As geographic risk regions expand, it is prudent to support robust surveillance programs that can measure tick infection rates, and communicate findings to clinicians, veterinarians, and the general public. The molecular technique of nested polymerase chain reaction (nPCR) has long been used for this purpose, and it remains a central, inexpensive, and robust approach in the detection of Borrelia in both ticks and wildlife. 
This article demonstrates the application of nPCR to tick DNA extracts to identify infected specimens. Two independent B. burgdorferi targets, genes encoding Flagellin B (FlaB) and Outer surface protein A (OspA), have been used extensively with this technique. The protocol involves tick collection, DNA extraction, and then an initial round of PCR to detect each of the two Borrelia-specific loci. Subsequent polymerase chain reaction (PCR) uses the product of the first reaction as a new template to generate smaller, internal amplification fragments. The nested approach improves upon both the specificity and sensitivity of conventional PCR. A tick is considered positive for the pathogen when inner amplicons from both Borrelia genes can be detected by agarose gel electrophoresis.

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Nested PCR is a sensitive, specific, and straightforward technique that can be applied to tick DNA extracts to probe for Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme disease. The initial PCR experiment uses gene-specific primers to generate long amplicons, which then become templates for a subsequent reaction using internal primers.

중첩된 한 PCR를 사용 하 여 틱에서 라임 질병 스피로, 보렐 리아 Burgdorferi, 감지

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

음 세포 기관이 격리 키트를 사용 하 여 급속 한 지질 작은 물방울 격리 프로토콜

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...