我々は感謝の技術支援と多くの有用な議論をLynntech、Inc。でT. Ragucci、B. Watkins氏、S.ウォン、AとB Wallekに感謝。この作品は、助成金CBET - 0933688の下で米国国立科学財団（NSF）によってサポートされていました。

1。対流サーモの基本設計<ol><li>我々は、その温度が独立して（図2）7を制御される2つのアルミニウム板に挟まれている交換可能なプラスチック製の反応室&quot;カートリッジ&quot;から構成されるシンプルな対流熱サイクル装置を構築した。 </li><li>円筒型反応器の井戸は、穴径と希望のアスペクト比（高さ/直径= H / D）を実現するために採用プラスチックシートの厚さの異なる組み合わせで、ポリカーボネートブロックの穴の加工配列で埋め込 ​​まれています。二つの異なる原子炉の形状は、ここに示された結果では考慮されています：H / D = 9：H = 15.9ミリメートル、D = 1.75ミリメートル、38.2μLボリューム、H / D = 3：H = 6.02ミリメートル、D = 1.98ミリメートル、18.5μLボリューム。 </li><li>原子炉の底部表面はmicroprocesser駆動型温度コントローラとインタフェースするカートリッジヒーターを含むアルミブロックを使用して加熱される。 </li><li>原子炉の上面の温度は循環水浴に接続されているアルミブロックを使用して調節されている。 </li><li>アセンブリ全体は、対向アルミブロックの間の熱伝導を制限するために、ナイロンのネジを使用して、一緒にクランプされます。 </li></ol> 2。 PCR反応混合物の調製とローディング<ol><li>典型的な100μL反応混合物は、10 ×緩衝液の10μL、25 mMのMgCl 2、dNTPの10μL（2 mMの各）6μL、DI水、β-アクチンプローブ、βの10μLの10μLの41.2μLを含んでいます-アクチンフォワードプライマー、β-アクチンのリバースプライマーの10μL、ヒトゲノム鋳型DNA（10 ng /μLの）2μLおよびKOD DNAポリメラーゼ（2.5単位/μL）0.8μL。 </li><li>試薬をロードする前に、アルミテープの薄いシートを用いてPCRチャンバの底部表面をシール。 </li><li>レイン- Xアンチフォグが続くウシ血清アルブミン10 mg / mLの水溶液で原子炉ウェルを洗浄します。 </li><li>長いゲルローディングピペットチップを使用し、FEPテフロンテープで上面をシール原子炉ウェルにピペットで試薬。 </li></ol> 3。対流サーモで反応を実行する<ol><li>希望の上側と下側表面の温度に反応、予熱アルミブロックの両方を開始する前に。 </li><li>サンドイッチは、プラスチック製の原子炉はアルミの加熱ブロック間のPCR試薬をロード、そして迅速にナイロンネジを使用して、一緒にアセンブリをクランプする。 </li><li>反応は、所望の時間のために進行した後に、ヒーターのスイッチをオフにし、急速にそれを冷却し、対流を停止するには冷やした金属ブロックの上にデバイスの下側（ホット）表面に置きます。 </li><li>プラスチック製の原子炉を取り外し、その後の分析のための井戸（長いゲルローディングチップを使用して）から製品をピペット。 </li></ol> 4。ゲル電気泳動分析の実行<ol><li>溶液が透明になるまで攪拌しながらホットプレート上で1 ×バッファー500mlでアガロース10gを加熱することにより、2重量％アガロースゲルを準備します。 </li><li>キャスティングトレイにアガロースゲルをロードし、コームを挿入する。 〜30分間ゲルをセットしてみましょう。 </li><li>櫛を削除し、ゲルが水没するまで、1 × TAEバッファーを添加します。 </li><li>蛍光染色したDNAサンプルは、2μL100 × SYBRグリーンI溶液、2μLのDNAサンプルを、2μL6Xオレンジローディング色素、及び4μLのTAE緩衝液が含まれています。 </li><li>ウェルにDNAサンプルを追加し、マーカーのサイズを設定する100 bpのDNAラダーで1時間60 Vでの分離を実行します。 </li><li>ゲルを取り出して、結果を得るために、UV光の下でそれを撮影する。 </li></ol> 5。代表的な結果： 対流サーモサイクラーの最適設計は、PCRプロセスに関与する主要な温度によって試薬を輸送することができる循環流を生成する正しい反応器形状を選択、。ここで考えている円筒状の炉に変化させることができる幾何学的パラメータは、高さ（H）と直径（D）、または同等のアスペクト比（H / D）です。我々は、数値流体力学（CFD）を使用して、異なるアスペクト比の範囲で対流PCR反応装置内部の3次元流れ場を検討し、予想外に複雑なパターンが生じることを見出した。さらに重要なことは、我々の分析では有意に反応12加速これらの複雑な流れ場の一部を明らかにした。 これらの幾何学的効果が明らかに高く、低アスペクト比で反応器における流れ場を比較することによって見ることができます。高アスペクト比の場合（H / D = 9、背が高く、細い円柱）、流体要素は本質的にループを閉じているパスをトレースする軌道に沿って移流され、そして彼らは長時間、同じパスに従うようにロックインです。時間（図3a）。したがって、fの間の交換のための少し機会があるPCR（アニーリングおよび原子炉の上部と下部の表面に極端な変性の間で振動する）と（中心に近いローカライズ増幅に寄与していない残りの軌道のはるかに大きいアンサンブルのための温度条件の最適な順序に試薬を公開する低軌道原子炉の）。 流体要素の軌跡は、もはや閉じたパス（図3b）に従うという意味で、より混沌となって、、流れ場が小さく、アスペクト比（短く、広い円柱H / D = 3）で大きく異なっています。このように、試薬がより複雑な温度プロファイルにさらさ​​れていても、流体要素は、試薬量のより多くの、最適な温度プロファイルを体験する機会を持つように軌道のはるかに広い範囲を探索することができます。これらの結果は反しH / D在学中の個々の流れの軌跡が= 9が温度プロファイルを生成することにより、PCRのために有利なように見えることを示唆していること、従来のサーマルサイクラー、/ hで流れ場のカオス的性質に用いられるものと同様の&quot;外観&quot; D = 3、最終的には試薬は非常に長いために不利な軌道に閉じ込められることがないよう強化された交流を促進することにより、グローバル規模で支配する。 この仮説を検証し、原子炉の形状は​​、PCRのためのより有利であったかを判断するために、我々は、人間のゲノムDNAテンプレートからのβ-アクチン遺伝子に関連付けられている295 bpのターゲットのPCR複製を実行するために、それらの両方を使用していました。検出可能な製品を前に少なくとも20分必要となる同じ反応はH / D = 9（図4b）で観察された驚くべきことに、我々は日常的に、H / D = 3（図4a）でわずか10分で正しいターゲット製品の増幅を達成。反応特異性は、複数の非特異的な製品はH / D = 9ここで、流れ場のトラップを長時間不利な熱軌道内の流体要素で生成される一方、単一のPCR産物が、得られる= 3 時間/ dでもはるかに大きいです。 <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。上部と下部の表面異なる固定温度で維持されている円筒状のチャンバー内の熱対流。底面の温度が上部よりも高い場合、垂直方向の密度勾配は、循環流のパターンを生成することが可能な密閉型流体内に確立されます。幾何学的パラメータの正しい選択（ 高さhと直径D）と、対流の流れ場は、上部と下部の表面は（重力が垂直下方に作用する）をそれぞれ、アニーリング温度や変性近くmanintainedされているPCRの熱サイクルを作動させるために活かしたことができます。 <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="図2" /> 図2（）対流PCR thermocylerのキーコンポーネント。原子炉のカートリッジは、円筒状のチャンバーの配列を含むポリカーボネートブロックで構成されています。ブロックは循環水浴と埋め込まれたヒーターを組み込んだ底板に接続するように設計されたトッププレートの間に挟まれている。 （B）PCRの試薬 ​​は装置が反応を行うために組み付けた後に、ロードされ、原子炉のカートリッジ内に封入されています。完了すると、procuctsは簡単に、その後の分析のために出ピペッティングすることができます。 <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。53および96の温度と円筒形の炉の内部で生成した3次元対流場の計算機シミュレーション° Cそれぞれ、上面及び下面に課される。結果は、（a）H / D = 9（38.2μL反応器容積）と（b）H / D = 3（18.5μL反応器容積）のアスペクト比で表示されます。三次元流れ場を通過する流体要素に続いて代表の軌跡は、トップとパスの側面図の投影と一緒に左に表示されている、流体要素は、次の温度対時間の対応するプロットは、右側に表示されています。 H / D = 9時の熱プロファイルは、従来のサーマルサイクラーに近いように見えますが、H / D = 3における混沌とした流れ場では、PCRに反し、より有利で ​​す。 <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="図4" /> 図4 DNAの複製図3（表面はそれぞれ、53および96 ° Cに維持された上部および下部）に示すように原子炉のジオメトリで得られた結果。 （A）PCRは、大幅に反応時間がわずか10分（100 bpのラダー、レーン1-4：4つの異なる円筒状のチャンバー内での並列反応から製品M）の後に目に見える強力な副生成物として明らかに、H / D = 3で加速される。 （B </strオング&gt;）（M見える製品が観察される前に、H / D = 9で実行した時と同じ反応は、少なくとも20分を必要とし、複数のバンドは、所望の生成物に加えて、非特異的な標的DNAの明らか示す複製です：100 bpのラダー、レーン1-2：異なる2つの円筒状のチャンバーでパラレル反応の製品）。

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利害の衝突は宣言されません。

流れと化学反応の相互作用は、カオス的移流の影響を受けて大幅に変更することができます。しかし、これらの複雑な流れの状態は、特に3Dの効果が重要になって現実的なジオメトリで、勉強に挑戦しています。レイリーベナール対流は、H / D&gt; 1だけでなく、これらの現象を探索するのに便利なプラットフォームを提供で、PCRを行うために、そのアプリケーションはまた、プローブする流れと化学反応との間の結合が可能になります。このユニークな機能により、DNA複製の速度を加速する混沌とした効果行為（反し）最適なフローの状態を選択することが可能になります。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>KOD DNA Polymerase kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>71085-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TaqMan &beta;-actin Control Reagents kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>401846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axygen, Inc.</td>
<td>PCR-AS-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A2153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X Anti-Fog</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SOPUS Products</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Long Gel-loading Pipette Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-408-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FEP Teflon tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>7562A17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agarose gel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-3107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TAE running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>141-0743</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYBR Green I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
<td>S7563</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6x Orange Loading Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>R0631</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 bp DNA ladder sizing marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>170-8202</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rapid pcr thermocycling using microscale thermal convection

多くの分子生物学的アッセイは、検出可能な濃度レベルに最初に希薄な標的DNAサンプルを増幅するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に何らかの形で依存する。しかし、従来のPCRの熱サイクルのハードウェアの設計は、主にその温度の熱電ヒーターによって調節され、深刻な達成可能な反応速度1を制限する大規模な金属製の加熱ブロックに基づく。かなりの電力は、ポータブルな形式でこれらの機器を展開する能力を制限し、繰り返し試薬の混合物を加熱し、冷却するために必要です。 熱対流は、これらの制限の2-9を克服する可能性を秘めている有望な代替の熱サイクルアプローチとして浮上している。対流フローは、地球の大気、海洋、そしてインテリアから、装飾的でカラフルな溶岩のランプに至るまでの設定の多様な配列では日常茶飯事です。流体の運動は、各ケースで同じ方法で開始されます。浮力駆動型不安定性は、流体の閉じ込めボリュームが空間的な温度勾配にさらされている場合に発生します。これらの同じ現象はPCR熱サイクルを実行するための魅力的な方法を提供します。適切に設計された原子炉の形状全体の静的温度勾配​​を適用することにより、連続的な循環流を繰り返し、変性、アニーリングおよび反応（図1）の拡張の段階に関連する温度帯によってPCR試薬を輸送することを確立することができます。熱サイクルは、したがって、完全に繰り返し加熱し、楽器を冷却する必要がなくなり、単に一定の温度で2つの対向面を保持することによって疑似等温的に作動させることができる。 対流サーモサイクラーの設計が直面する主な課題の一つは、試薬が順次時間10,11の十分な期間、適切な温度帯を占有することを保証するために原子炉内空間速度と温度分布を正確に制御する必要がありますされています。ここでは、マイクロスケール対流サーモサイクラー12でフル3次元速度と温度分布を調べるために我々の努力の成果を説明。突然、私たちは最適な温度プロファイルの完全な範囲をサンプリングするための試薬のための強化の機会を提供する流路の間で（1）継続的な交流の相乗組み合わせによるPCRのために非常に有利な複雑な流れの軌道の一部を発見、としている（ 2）増加時間は、拡張温度ゾーン内のPCRのレート制限ステップを過ごした。非常に迅速なDNAの増幅時間は（10分未満）、これらのフローを生成するように設計された原子炉で達成可能です。

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Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

我々は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を経由してDNA複製を実行する新規な方法を説明します。熱対流は、一定温度で反応器の対向面を維持することによって、変性アニーリング、および拡張子の条件の間に連続してシャトルの試薬に活かされている。この本質的にシンプルなデザインは、迅速なPCRをよりアクセシブルにすることを約束。

ミクロ熱対流を使用して迅速なPCRの熱サイクル

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

rapid-pcr-thermocycling-using-microscale-thermal-convection

Research

JoVE Journal

Biology

22.6K ビュー.  Texas A&M University. 我々は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を経由してDNA複製を実行する新規な方法を説明します。熱対流は、一定温度で反応器の対向面を維持することによって、変性アニーリング、および拡張子の条件の間に連続してシャトルの試薬に活かされている。この本質的にシンプルなデザインは、迅速なPCRをよりアクセシブルにすることを約束。

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Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma&#039;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

シグマのエキス- N - Ampの組織PCRキットを使用してマウス組織の急速なジェノタイピング

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

生物学

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRアッセイを用いて定量的リアルタイムPCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

磁気変調バイオセンシングシステムを用いた生物学的アッセイの迅速な均質な検出

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

エメラルドアッシュボーラーの遺伝子発現の解析（ Agrilus planipennis）を使用して定量的リアルタイム- PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

定量リアルタイムPCR（定量PCR）アレイを用いたプレマイクロRNAとマイクロRNAのプロファイリング

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

で遺伝子発現プロファイルを決定 C.エレガンスマイクロアレイとリアルタイムPCRを用いて

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

マイコプラズマの最適化されたPCRベースの検出

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to humans through the bite of infected Ixodes ticks. The primary etiological agent in North America is Borrelia burgdorferi sensu stricto. As geographic risk regions expand, it is prudent to support robust surveillance programs that can measure tick infection rates, and communicate findings to clinicians, veterinarians, and the general public. The molecular technique of nested polymerase chain reaction (nPCR) has long been used for this purpose, and it remains a central, inexpensive, and robust approach in the detection of Borrelia in both ticks and wildlife. 
This article demonstrates the application of nPCR to tick DNA extracts to identify infected specimens. Two independent B. burgdorferi targets, genes encoding Flagellin B (FlaB) and Outer surface protein A (OspA), have been used extensively with this technique. The protocol involves tick collection, DNA extraction, and then an initial round of PCR to detect each of the two Borrelia-specific loci. Subsequent polymerase chain reaction (PCR) uses the product of the first reaction as a new template to generate smaller, internal amplification fragments. The nested approach improves upon both the specificity and sensitivity of conventional PCR. A tick is considered positive for the pathogen when inner amplicons from both Borrelia genes can be detected by agarose gel electrophoresis.

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Nested PCR is a sensitive, specific, and straightforward technique that can be applied to tick DNA extracts to probe for Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme disease. The initial PCR experiment uses gene-specific primers to generate long amplicons, which then become templates for a subsequent reaction using internal primers.

Nested pcr 法を使用してのタイマー刻みでライム病ライム病スピロヘータを検出

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...