Si ringrazia T. Ragucci, B. Watkins, S. Wong, e B. Wallek a Lynntech, Inc. per l&#39;assistenza tecnica e molte utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto dalla US National Science Foundation (NSF) sotto concedere cbet-0933688.

1. Progettazione di base del termociclatore convettivo <ol><li> Abbiamo costruito un dispositivo semplice ciclo termico convettivo composto da intercambiabili in plastica reazione da camera &quot;cartucce&quot; che sono inserito tra due lastre di alluminio le cui temperature sono controllati indipendentemente 7 (Figura 2). </li><li> Pozzi reattore cilindrico vengono incorporati per gli array lavorazione di fori in blocchi in policarbonato, con diverse combinazioni di diametro del foro e spessore del foglio di plastica utilizzato per ottenere le proporzioni desiderate (altezza / diametro = h / d). Due diverse geometrie del reattore sono considerati nei risultati qui presentati: h / d = 9: h = 15,9 mm, d = 1,75 mm, 38,2 microlitri volume; h / d = 3: h = 6.02 mm, d = 1,98 millimetri, 18,5 microlitri volume. </li><li> La superficie inferiore del reattore è riscaldata utilizzando un blocco di alluminio contenenti riscaldatori a cartuccia interfacciato con un regolatore di temperatura guidato microprocesser. </li><li> La temperatura alla superficie superiore del reattore è regolata utilizzando un blocco di alluminio collegato a un bagno d&#39;acqua di ricircolo. </li><li> Tutta l&#39;assemblea è bloccato insieme usando viti di nylon per limitare conduzione termica tra i blocchi contrapposti in alluminio. </li></ol> 2. Preparazione e caricamento della miscela di reazione PCR <ol><li> Una tipica miscela di reazione 100 microlitri contiene 10 ml di soluzione tampone 10x, 6 ml di 25 mM MgCl 2, 10 l di dNTPs (2 mm ciascuno), 41,2 ml di acqua deionizzata, 10 ml di β-actina sonda, 10 ml di β -actina in avanti fondo, 10 ml di β-actina fondo inverso, 2 l di DNA umano modello genomico (10 ng / mL) e 0,8 l di DNA polimerasi KOD (2,5 unità / mL). </li><li> Prima di caricare i reagenti, sigillare la superficie inferiore della camera di PCR utilizzando un sottile strato di nastro di alluminio. </li><li> Sciacquare i pozzi reattore con 10 mg / mL di soluzione acquosa di albumina sierica bovina seguito da Rain-X Anti-Fog. </li><li> Reagenti Pipettare nei pozzetti reattore usando lungo gel-loading puntali e sigillare la superficie superiore con del nastro Teflon FEP. </li></ol> 3. Esecuzione della reazione nel termociclatore convettivo <ol><li> Prima di iniziare la reazione, preriscaldare i due blocchi di alluminio per le temperature desiderate superficie superiore e inferiore. </li><li> Sandwich il reattore di plastica cariche di reagenti PCR tra i blocchi di riscaldamento in alluminio, e rapidamente morsetto l&#39;assemblea insieme con le viti in nylon. </li><li> Dopo la reazione è proceduto per il tempo desiderato, spegnere il riscaldamento e il luogo inferiore (a caldo) della superficie del dispositivo sulla cima di un blocco di metallo refrigerato per raffreddare rapidamente e fermare il flusso convettivo. </li><li> Rimuovere il reattore di plastica e pipetta prodotti dalle fonti (con punte di carico lungo il gel) per successive analisi. </li></ol> 4. Esecuzione di analisi gel elettroforesi <ol><li> Preparare un peso del 2% gel riscaldando 10 g di agarosio con 500 ml di tampone 1x su un piatto caldo mescolando fino a quando la soluzione diventa chiara. </li><li> Caricare il gel nel cassetto casting e inserire il pettine. Lasciate che i set di gel per circa 30 min. </li><li> Togliere il pettine e aggiungere 1x tampone TAE fino a quando il gel è sommerso. </li><li> Fluorescenza campioni di DNA macchiato contenere 2 microlitri 100x SYBR Green soluzione I, 2 campione di DNA microlitri, 2 microlitri 6x Dye Caricamento Orange, e 4 microlitri di buffer TAE. </li><li> Aggiungere i campioni di DNA nei pozzetti ed eseguire il distacco a 60 V per 1 h con un DNA di 100 bp scala marcatore dimensionamento. </li><li> Rimuovere il gel e fotografare sotto la luce UV per ottenere il risultato. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Progettazione ottimale di termociclatori convettivi comporta la scelta della corretta geometria del reattore che genererà un flusso circolatorio in grado di trasportare i reagenti attraverso le temperature chiave coinvolti nel processo di PCR. I parametri geometrici che possono essere modificate in reattori cilindrici qui considerati sono l&#39;altezza (h) e diametro (d), o equivalentemente il rapporto di aspetto (h / d). Abbiamo esplorato il 3-D campi di flusso convettivo all&#39;interno dei reattori PCR su una gamma di differenti formati utilizzando fluidodinamica computazionale (CFD), ed ha trovato che i modelli complessi possono insorgere inaspettatamente. Ancora più importante, la nostra analisi ha scoperto un sottoinsieme di questi campi di flusso complessi che accelerare in maniera significativa la reazione 12. Questi effetti geometrici può essere vista chiaramente confrontando i campi di flusso nei reattori a proporzioni alte e basse. Nel caso in alto rapporto di aspetto (h / d = 9; un alto, magro cilindro), elementi fluidi sono convogliati lungo traiettorie tracciare percorsi che sono essenzialmente perimetri chiusi, e sono locked-in per seguire gli stessi percorsi per lunghi periodi di tempo (Figura 3a). Di conseguenza, ci sono poche opportunità di scambio tra ftraiettorie basso che esporre i reagenti per la sequenza ottimale delle condizioni termiche per la PCR (oscillante tra il ricottura e denaturazione estremi sulle superfici superiore e inferiore del reattore) e l&#39;insieme molto più grande di traiettorie rimanenti che non contribuiscono alla amplificazione (localizzata vicino al centro del reattore). Il campo di flusso è molto diverso in un rapporto di formato più piccolo (h / d = 3; una più breve, cilindro più ampio), diventando sempre più caotica, nel senso che le traiettorie elemento fluido non seguono più tracciati chiusi (Figura 3b). Così, anche se i reagenti vengono sottoposti ad un profilo di temperatura più complesso, elementi fluidi sono in grado di esplorare una gamma molto più ampia di traiettorie in modo che più del volume di reagente ha l&#39;opportunità di un&#39;esperienza ottimale profili termici. Counterintuitively Questi risultati suggeriscono che, mentre le traiettorie del flusso singoli h / d = 9 può apparire più favorevole per PCR con la produzione di profili di temperatura che &quot;look&quot; simile a quelli impiegati in un termociclatore convenzionale, la natura caotica del campo di moto in h / d = 3 domina in ultima analisi, su scala globale, promuovendo lo scambio migliorato in modo che i reagenti non restare intrappolati nelle traiettorie sfavorevoli per molto tempo. Per verificare questa ipotesi e stabilire quali la geometria del reattore è stata più favorevole per la PCR, abbiamo usato tutti e due a eseguire la replica di un obiettivo PCR 295 bp associata alla β-actina gene da un modello umano del DNA genomico. Sorprendentemente, abbiamo raggiunto regolarmente l&#39;amplificazione del prodotto bersaglio corretto in soli 10 min a h / d = 3 (Figura 4a), mentre la stessa reazione richiesto almeno 20 minuti prima che i prodotti rilevabili sono stati osservati h / d = 9 (Fig. 4b) . La specificità di reazione è molto maggiore di h / d = 3, dove un singolo prodotto PCR è ottenuta, pur essendo più prodotti non specifici vengono generati h / d = 9 dove le trappole flusso di elementi fluidi in campo sfavorevole traiettorie termica per lunghi periodi di tempo. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Convezione termica in una camera cilindrica di cui sopra e sotto le superfici sono mantenuti a diverse temperature fisso. Se la temperatura alla superficie inferiore è più alto nella parte superiore, un gradiente di densità verticale è stabilita entro il fluido racchiuso in grado di generare un modello di flusso circolatorio. Con la giusta scelta dei parametri geometrici (altezza h e diametro d), il campo di flusso convettivo può essere sfruttata per azionare termici PCR quando le superfici superiore e inferiore sono manintained vicino ricottura e denaturazione temperature, rispettivamente (gravità agisce verticalmente verso il basso). <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. (A) I componenti chiave di un flusso convettivo PCR thermocyler. Una cartuccia reattore è costituito da un blocco di policarbonato contenente una serie di camere cilindriche. Il blocco è inserita tra una piastra superiore progettato per essere collegato ad un bagno d&#39;acqua in circolazione e un piatto fondo incorporando riscaldamento incorporato. (B) I reagenti PCR vengono caricati e sigillati all&#39;interno della cartuccia reattore, dopo di che il dispositivo è montato di effettuare la reazione. Al termine, la procucts può essere facilmente pipettati per successive analisi. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Simulazioni computazionali di 3-D campi di flusso convettivo generato all&#39;interno dei reattori cilindrici con temperature di 53 e 96 ° C imposto alle superfici superiore e inferiore, rispettivamente. I risultati sono mostrati in proporzioni di (a) h / d = 9 (38.2 volume del reattore mL) e (b) h / d = 3 (18.5 volume del reattore mL). Un rappresentante traiettoria seguita da un elemento fluido che viaggiano attraverso il campo di flusso 3D è visibile a sinistra insieme a proiezioni di vista superiore e laterale del percorso, la trama corrispondente della temperatura in funzione del tempo a seguito di un elemento fluido è mostrato a destra. Il profilo termico in h / d = 9 sembra vicina a quella di un termociclatore convenzionale, ma il campo di flusso caotico di h / d = 3 è counterintuitively più favorevole per la PCR. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Replicazione del DNA risultati ottenuti nelle geometrie del reattore mostrato nella Figura 3 (superiore ed inferiore superfici sono state mantenute a 53 e 96 ° C, rispettivamente). (A) PCR è fortemente accelerato a h / d = 3, come risulta evidente dai prodotti forti visibili dopo soli 10 minuti di tempo di reazione (M: 100 bp scaletta, corsie 1-4: i prodotti da reazioni parallele in 4 differenti camere cilindriche). (B </strong&gt;) La stessa reazione eseguita h / d = 9 sono necessari almeno 20 minuti prima che i prodotti visibili sono osservate, e le bande sono più evidenti che indicano la replicazione del DNA non specifico obiettivo, oltre al prodotto desiderato (M: 100 bp scala, corsie 1-2: i prodotti da reazioni parallele in due differenti camere cilindriche).

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	<li>Spitzack, K. D., Ugaz, V. M., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Techniques:+Reviews+and+Protocols.">Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2005).</li><li>Krishnan, M., Ugaz, V. M., Burns, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+in+a+Rayleigh-B&#233;nard+convection+cell.">PCR in a Rayleigh-B&#233;nard convection cell.</a> Science. 298, 793-793 (2002).</li><li>Braun, D., Goddard, N. L., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exponential+DNA+replication+by+laminar+convection.">Exponential DNA replication by laminar convection.</a> Physical Review Letters. 91, 158103-158103 (2003).</li><li>Chen, Z., Qian, S., Abrams, W. R., Malamud, D., Bau, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermosiphon-based+PCR+reactor:+experiment+and+modeling.">Thermosiphon-based PCR reactor: experiment and modeling.</a> Analytical Chemistry. 76, 3707-3715 (2004).</li><li>Wheeler, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convectively+driven+polymerase+chain+reaction+thermal+cycler.">Convectively driven polymerase chain reaction thermal cycler.</a> Analytical Chemistry. 76, 4011-4016 (2004).</li><li>Krishnan, M., Agrawal, N., Burns, M. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+and+fluidics+in+miniaturized+natural+convection+systems.">Reactions and fluidics in miniaturized natural convection systems.</a> Analytical Chemistry. 76, 6254-6265 (2004).</li><li>Ugaz, V. M., Krishnan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+convective+flow+based+approaches+for+high-throughput+PCR+thermocycling.">Novel convective flow based approaches for high-throughput PCR thermocycling.</a> Journal of the Association for Laboratory Automation (JALA). 9, 318-323 (2004).</li><li>Yao, D. J., Chen, J. R., Ju, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-Rayleigh-Benard+convection+polymerase+chain+reaction+system.">Micro-Rayleigh-Benard convection polymerase chain reaction system.</a> Journal of Micro-Nanolithography MEMS and MOEMS. 6, 043007-043007 (2007).</li><li>Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pocket-sized+Convective+PCR+Thermocycler.">A Pocket-sized Convective PCR Thermocycler.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46, 4316-4319 (2007).</li><li>Yariv, E., Ben-Dov, G., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction+in+natural+convection+systems:+A+convection-diffusion-reaction+model.">Polymerase chain reaction in natural convection systems: A convection-diffusion-reaction model.</a> Europhysics Letters. 71, 1008-1014 (2005).</li><li>Allen, J. W., Kenward, M., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+flow+and+reaction+during+natural+convection+PCR.">Coupled flow and reaction during natural convection PCR.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 6, 121-130 (2009).</li><li>Muddu, R., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+Biochemistry+by+Chaotic+Stirring.">Accelerated Biochemistry by Chaotic Stirring.</a> , (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;interazione tra flusso e la reazione chimica può cambiare drasticamente sotto l&#39;influenza di avvezione caotica. Ma questi stati di flusso complessi sono difficili da studiare, in particolare nelle geometrie reale, in cui gli effetti 3D diventano importanti. Rayleigh-Bénard convezione a / p&gt; 1 non solo fornisce una comoda piattaforma per esplorare questi fenomeni, la loro applicazione per eseguire PCR permette anche l&#39;accoppiamento tra flusso e reazioni chimiche di essere indagato. Questa funzionalità unica consente di selezionare gli stati di flusso ottimale dove caotico agire effetti (counterintuitively) per accelerare la velocità di replicazione del DNA.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>KOD DNA Polymerase kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>71085-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TaqMan &beta;-actin Control Reagents kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>401846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axygen, Inc.</td>
<td>PCR-AS-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A2153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X Anti-Fog</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SOPUS Products</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Long Gel-loading Pipette Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-408-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FEP Teflon tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>7562A17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agarose gel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-3107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TAE running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>141-0743</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYBR Green I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
<td>S7563</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6x Orange Loading Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>R0631</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 bp DNA ladder sizing marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>170-8202</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rapid pcr thermocycling using microscale thermal convection

Molti test di biologia molecolare dipendono in qualche modo la reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare un inizialmente diluire il campione di DNA bersaglio a livelli di concentrazione rilevabile. Ma la progettazione di hardware convenzionale termocicli PCR, prevalentemente sulla base di massicci blocchi di riscaldamento metallo la cui temperatura è regolata da riscaldamento termoelettrico, limita fortemente la velocità raggiungibile di reazione 1. Notevole energia elettrica è necessaria anche per riscaldare e raffreddare ripetutamente la miscela di reazione, limitando la possibilità di distribuire questi strumenti in un formato portatile. Convezione termica è emerso come un approccio promettente termici alternativa che ha il potenziale per superare queste limitazioni 2-9. Flussi convettivi sono all&#39;ordine del giorno in una vasta gamma di impostazioni che vanno dalla atmosfera terrestre, gli oceani, e gli interni, di lampade lava decorativa e colorata. Movimento fluido è iniziato nello stesso modo in ogni caso: una instabilità dell&#39;assetto guidato nasce quando un volume limitato di liquido è sottoposto ad un gradiente di temperatura spaziale. Questi stessi fenomeni offrire un modo interessante per eseguire termici PCR. Applicando un gradiente di temperatura statica attraverso una geometria del reattore concepiti in modo appropriato, un continuo flusso circolatorio può essere stabilito che ripetutamente trasporto reagenti PCR attraverso zone di temperatura associata alla denaturazione, ricottura, estensione e le fasi della reazione (Figura 1). Termici può quindi essere azionato in una pseudo-isotermico maniera semplicemente tenendo due superfici opposte a temperature fisse, eliminando completamente la necessità di riscaldare e raffreddare ripetutamente lo strumento. Una delle principali sfide per la progettazione di termociclatori convettiva è la necessità di controllare con precisione la velocità spaziale e distribuzione della temperatura all&#39;interno del reattore per assicurare che i reagenti in sequenza occupano le zone di temperatura corretta per un periodo di tempo sufficiente 10,11. Qui si descrivono i risultati dei nostri sforzi per sondare la piena 3-D di velocità e distribuzione della temperatura in microscala convettivo termociclatori 12. Inaspettatamente, abbiamo scoperto un sottoinsieme delle traiettorie di flusso complessi che sono molto favorevoli per PCR a causa di una combinazione sinergica di (1) lo scambio continuo tra i percorsi di flusso che offre l&#39;opportunità migliore per i reagenti per assaggiare l&#39;intera gamma di profili di temperatura ottimale, e ( 2) aumento del tempo speso all&#39;interno della zona di temperatura estensione il fattore limitante della PCR. Estremamente rapidi tempi di amplificazione del DNA (sotto i 10 min) sono realizzabili in reattori progettati per generare questi flussi.

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Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Descriviamo un nuovo metodo per eseguire la replicazione del DNA tramite la reazione a catena della polimerasi (PCR). Convezione termica viene sfruttata per reagenti navetta continuo tra denaturazione, ricottura, e le condizioni di estensione, mantenendo opposte superfici del reattore a temperatura costante. Questo design intrinsecamente semplice promette di rendere rapido PCR più accessibile.

Rapido PCR termici utilizzando microscala convezione termica

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

rapid-pcr-thermocycling-using-microscale-thermal-convection

Research

JoVE Journal

Biology

22.6K Views.  Texas A&M University. Descriviamo un nuovo metodo per eseguire la replicazione del DNA tramite la reazione a catena della polimerasi (PCR). Convezione termica viene sfruttata per reagenti navetta continuo tra denaturazione, ricottura, e le condizioni di estensione, mantenendo opposte superfici del reattore a temperatura costante. Questo design intrinsecamente semplice promette di rendere rapido PCR più accessibile.

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Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma&#039;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

Genotipizzazione rapida del tessuto mouse utilizzando Sigma Extract-N-Amp PCR Tissue Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Ricerca

Biologia

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitativa Real-Time PCR utilizzando il Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Rapida rilevazione omogenea dei saggi biologici Utilizzando Magnetic biopercezione sistema di modulazione

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analisi dell&#39;espressione genica in Borer Emerald Ash ( Agrilus planipennis) Utilizzando quantitativa Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profilatura di pre-micro-RNA e microRNA con Quantitative Real-time PCR (qPCR) Array

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Determinare profili di espressione genetica in C. elegans Utilizzo Microarray e Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

Ottimizzati basati sulla PCR Rilevazione di Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to humans through the bite of infected Ixodes ticks. The primary etiological agent in North America is Borrelia burgdorferi sensu stricto. As geographic risk regions expand, it is prudent to support robust surveillance programs that can measure tick infection rates, and communicate findings to clinicians, veterinarians, and the general public. The molecular technique of nested polymerase chain reaction (nPCR) has long been used for this purpose, and it remains a central, inexpensive, and robust approach in the detection of Borrelia in both ticks and wildlife. 
This article demonstrates the application of nPCR to tick DNA extracts to identify infected specimens. Two independent B. burgdorferi targets, genes encoding Flagellin B (FlaB) and Outer surface protein A (OspA), have been used extensively with this technique. The protocol involves tick collection, DNA extraction, and then an initial round of PCR to detect each of the two Borrelia-specific loci. Subsequent polymerase chain reaction (PCR) uses the product of the first reaction as a new template to generate smaller, internal amplification fragments. The nested approach improves upon both the specificity and sensitivity of conventional PCR. A tick is considered positive for the pathogen when inner amplicons from both Borrelia genes can be detected by agarose gel electrophoresis.

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Nested PCR is a sensitive, specific, and straightforward technique that can be applied to tick DNA extracts to probe for Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme disease. The initial PCR experiment uses gene-specific primers to generate long amplicons, which then become templates for a subsequent reaction using internal primers.

Rilevare il malattia di Lyme Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in segni di graduazione utilizzando la PCR annidata

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...