Nosotros agradecemos a T. Ragucci, Watkins B., S. Wong, y Wallek B. en Lynntech, Inc. para asistencia técnica y muchas discusiones útiles. Este trabajo fue apoyado por los EE.UU. National Science Foundation (NSF) en virtud de concesión CBET-0933688.

1. Diseño básico de la convección termociclador <ol><li> Hemos construido un sencillo dispositivo que consta de ciclos térmicos convectivo intercambiables de plástico reacción de la cámara &quot;cartuchos&quot; que se encuentra entre dos placas de aluminio, cuya temperatura se controla de forma independiente 7 (Figura 2). </li><li> Pozos cilíndricos reactor están integrados por conjuntos de mecanizado de agujeros en los bloques de policarbonato, con diferentes combinaciones de diámetro del agujero y espesor de la lámina de plástico empleadas para lograr las relaciones de aspecto que desee (altura / diámetro = h / d). Dos geometrías diferentes reactor se consideran en los resultados presentados aquí: h / d = 9: h = 15,9 mm, d = 1,75 mm, 38,2 l de volumen; h / d = 3: h = 6,02 mm, d = 1,98 mm, 18,5 l volumen. </li><li> La superficie del fondo del reactor se calienta con un bloque de aluminio que contiene los calentadores de cartucho de interfaz con un controlador de temperatura microprocesser impulsada. </li><li> La temperatura en la superficie superior del reactor se regula con un bloque de aluminio conectado a un baño de agua de recirculación. </li><li> Todo el conjunto se fija mediante tornillos de nylon para limitar la conducción térmica entre los bloques de aluminio de oposición. </li></ol> 2. Preparación y carga de la mezcla de reacción PCR <ol><li> Un típico de 100 l mezcla de reacción contiene 10 l de solución tampón 10x, 6 l de 25 mM MgCl 2, 10 l de dNTPs (2 mM cada uno), 41,2 l de agua desionizada, 10 l de β-actina de la sonda, 10 l de β -actina cebador, 10 L de primer inversa β-actina, 2 l de ADN genómico humano plantilla (10 ng / l) y 0,8 l de ADN polimerasa KOD (2,5 unidades / l). </li><li> Antes de cargar los reactivos, sellar la superficie inferior de la cámara de PCR utilizando una delgada lámina de cinta de aluminio. </li><li> Lave los pocillos con un reactor de 10 mg / ml de solución acuosa de albúmina de suero bovino seguido por la lluvia-X Anti-Fog. </li><li> Reactivos pipeta en los pozos de reactor con tiempo de carga de gel puntas de pipeta y sellar la superficie superior con cinta de teflón FEP. </li></ol> 3. Ejecución de la reacción en el termociclador convectiva <ol><li> Antes de iniciar la reacción, precalentar los dos bloques de aluminio a la temperatura deseada de la superficie superior e inferior. </li><li> Sandwich del reactor de plástico cargado con reactivos de PCR entre los bloques de aluminio para calefacción, y rápidamente apretar el montaje mediante tornillos de nylon. </li><li> Después de la reacción ha tenido lugar durante el tiempo deseado, apagar los calentadores y el lugar más bajo (caliente) la superficie del dispositivo en la parte superior de un bloque de metal enfriada rápidamente para que se enfríe y detener el flujo de convección. </li><li> Retire el reactor de plástico y una pipeta de los productos de las fuentes (con las puntas de gel de carga de largo) para su posterior análisis. </li></ol> 4. Realizar un análisis de electroforesis en gel <ol><li> Prepare un 2% en peso de gel de agarosa al calentar 10 g de agarosa con 500 ml de solución tampón 1x en un plato caliente revolviendo hasta que la solución se aclare. </li><li> Cargar el gel de agarosa en la bandeja de fundición e insertar el peine. Deje que el conjunto de gel de ~ 30 min. </li><li> Retirar el peine y añadir 1x tampón TAE hasta que el gel se sumerge. </li><li> Muestras teñidas con fluorescencia de ADN contienen 2 l 100x SYBR Green solución que, dos muestras de ADN l, 2 l colorante de carga 6x Orange, y 4 l buffer TAE. </li><li> Añadir las muestras de ADN en los pocillos y ejecutar la separación de 60 V durante 1 h con un marcador de 100 bp de ADN escalera de tamaño. </li><li> Quitar el gel y la fotografía bajo la luz UV para obtener el resultado. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Diseño óptimo de termocicladores convección consiste en elegir la correcta geometría del reactor que generará un flujo circulatorio, capaz de transportar los reactivos a través de las temperaturas clave que participan en el proceso de PCR. Los parámetros geométricos que se pueden variar en los reactores cilíndricos aquí consideradas son la altura (h) y diámetro (d), o equivalentemente la relación de aspecto (h / d). Hemos explorado los campos de flujo 3-D dentro de convección reactores de PCR en un rango de diferentes relaciones de aspecto utilizando la dinámica de fluidos computacional (CFD), y encontró que los patrones complejos pueden surgir inesperadamente. Más importante aún, nuestro análisis ha descubierto un subconjunto de estos campos de flujo complejo que aceleran de manera significativa la reacción 12. Estos efectos geométricos se puede ver claramente al comparar los campos de flujo en reactores de relaciones de aspecto de alta y baja. En el caso de la relación de aspecto de alto (h / d = 9; un cilindro alto y delgado), los elementos del fluido son advección a lo largo de trayectorias que trazan los caminos que son esencialmente circuitos cerrados, y que están encerrados en seguir el mismo camino durante largos períodos de tiempo (Figura 3a). En consecuencia, hay pocas oportunidades para el intercambio entre ftrayectorias bajas que exponga los reactivos a la secuencia óptima de las condiciones térmicas de PCR (que oscila entre el recocido y la desnaturalización extremos en las superficies superior e inferior del reactor) y el conjunto más grande de trayectorias restantes que no contribuyen a la amplificación (localizada cerca del centro del reactor). El campo de flujo es muy diferente a una relación de aspecto menor (h / d = 3, un menor, el cilindro más amplio), cada vez más caótica en el sentido de que las trayectorias líquido elemento ya no siguen los caminos cerrados (Figura 3b). Por lo tanto, a pesar de que los reactivos son sometidos a un perfil de temperatura más complejo, los elementos del fluido son capaces de explorar un rango más amplio de las trayectorias de modo que más del volumen de reactivo tiene una oportunidad para una óptima experiencia de perfiles térmicos. Estos resultados sugieren que mientras que contraintuitivamente trayectorias de flujo individual en h / d = 09 de mayo parecen ser más favorables para la PCR mediante la producción de perfiles de temperatura que &quot;look&quot; similar al empleado en un termociclador convencional, la naturaleza caótica del campo de flujo en h / d = 3 en última instancia, domina a escala mundial mediante la promoción de un mayor intercambio para que los reactivos no quedar atrapados en las trayectorias desfavorables por mucho tiempo. Para probar esta hipótesis y determinar que la geometría del reactor era más favorable para la PCR, se utilizaron dos de ellos para realizar la replicación de PCR de 295 pb un objetivo asociado con el gen de la β-actina de una plantilla de ADN genómico humano. Notablemente, de manera rutinaria lograr la amplificación del producto de destino correcto en sólo 10 minutos a h / d = 3 (Figura 4a), mientras que la misma reacción que requiere por lo menos 20 minutos antes de detectarse productos se observaron en h / d = 9 (Figura 4b) . La especificidad de la reacción es mucho mayor en h / d = 3, en un solo producto de PCR se obtiene, mientras que varios productos no específicos se generan en h / d = 9, donde las trampas de campo de flujo de fluidos en los elementos desfavorables trayectorias térmicas durante largos períodos de tiempo. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Convección térmica en una cámara cilíndrica cuya parte superior e inferior superficies se mantienen a diferentes temperaturas fijas. Si la temperatura en la superficie inferior es mayor que en la parte superior, un gradiente de densidad vertical se establece en el líquido cerrado que es capaz de generar un patrón de flujo circulatorio. Con la elección correcta de los parámetros geométricos (altura h y diámetro d), el campo de flujo de convección se puede aprovechar para accionar termociclado PCR cuando las superficies superior e inferior son manintained cerca de recocido y desnaturalización de las temperaturas, respectivamente (la gravedad actúa verticalmente hacia abajo). <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. (A) Los componentes clave de un flujo convectivo termociclador de PCR. Un cartucho de reactor consiste en un bloque de policarbonato que contiene una serie de cámaras cilíndricas. El bloque se encuentra entre una placa superior diseñado para ser conectado a un baño de agua circulante y una placa inferior que incorpora calentadores integrados. (B) los reactivos de PCR se han cargado y sellado en el interior del cartucho de reactor, después de que el dispositivo está montado para llevar a cabo la reacción. Al terminar, el procucts puede ser fácilmente pipeta para un análisis posterior. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Simulaciones computacionales de 3-D los campos de flujo de convección generadas dentro de los reactores cilíndricos, con temperaturas de 53 y 96 ° C impuestas en las superficies superior e inferior, respectivamente. Los resultados se muestran en relaciones de aspecto de (a) h / d = 9 (38,2 l volumen del reactor) y (b) h / d = 3 (18,5 l volumen del reactor). Un representante trayectoria seguida por un elemento de fluido viaja a través del campo de flujo en 3D se muestra a la izquierda junto con las proyecciones vista superior y lateral de la ruta, la gráfica correspondiente de la temperatura en función del tiempo después de un elemento de fluido se muestra a la derecha. El perfil térmico en h / d = 9 aparece próxima a la de un termociclador convencional, pero el campo de flujo caótico en h / d = 3 es contraintuitivamente más favorable para la PCR. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Los resultados de la replicación del ADN obtenido en las geometrías del reactor se muestra en la Figura 3 (superior e inferior de las superficies se mantuvieron en 53 y 96 ° C, respectivamente). (A) PCR se acelera en h / d = 3, como es evidente por los productos de fuerte y visible después de tan sólo 10 minutos de tiempo de reacción (M: escalera de 100 pb, carriles 1-4: los productos de las reacciones en paralelo en 4 diferentes cámaras cilíndricas). (B </strong&gt;) La misma reacción realizada en h / d = 9 requiere por lo menos 20 minutos antes de que los productos visibles se observan, y varias bandas son la replicación del ADN evidente que indica que no son objeto específico, además del producto deseado (M: escalera de 100 pb, carriles 1-2: los productos de las reacciones en paralelo en dos cámaras cilíndricas diferentes).

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La interacción entre el flujo y la reacción química puede cambiar drásticamente bajo la influencia de la advección caótica. Pero estos estados de flujo complejas son difíciles de estudiar, sobre todo en geometrías 3D realista donde los efectos se vuelven importantes. Rayleigh-Bénard convección en h / d&gt; 1, no sólo proporciona una plataforma conveniente para explorar estos fenómenos, su aplicación para realizar PCR también permite el acoplamiento entre las reacciones químicas y el flujo que se probaron. Esta capacidad única permite seleccionar los estados de flujo óptimo en el acto de efectos caóticos (contraintuitivamente) para acelerar la velocidad de replicación del ADN.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>KOD DNA Polymerase kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>71085-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TaqMan &beta;-actin Control Reagents kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>401846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axygen, Inc.</td>
<td>PCR-AS-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A2153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X Anti-Fog</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SOPUS Products</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Long Gel-loading Pipette Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-408-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FEP Teflon tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>7562A17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agarose gel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-3107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TAE running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>141-0743</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYBR Green I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
<td>S7563</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6x Orange Loading Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>R0631</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 bp DNA ladder sizing marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>170-8202</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rapid pcr thermocycling using microscale thermal convection

Muchos ensayos de biología molecular dependen de alguna manera en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar una muestra de ADN diana inicial se diluye a una concentración detectable. Pero el diseño de hardware convencionales termociclado PCR, en su mayoría sobre la base de enormes bloques de metal de calefacción, cuya temperatura es regulada por los calentadores de termoeléctricas, limita la velocidad de reacción alcanzables 1. Capacidad eléctrica es necesaria para calentar y enfriar repetidas veces la mezcla de reactivos, lo que limita la capacidad de implementar estos instrumentos en un formato portátil. Convección térmica ha surgido como un enfoque alternativo termociclado prometedor que tiene el potencial para superar estas limitaciones 2-9. Flujos convectivos son una ocurrencia diaria en una gran variedad de escenarios que van desde la atmósfera de la Tierra, los océanos, y el interior, a las lámparas de lava decorativa y colorida. El movimiento del fluido se inicia de la misma manera en cada caso: a la inestabilidad de flotabilidad impulsado surge cuando un volumen limitado de líquido es sometido a un gradiente de temperatura espacial. Estos mismos fenómenos constituyen un medio atractivo para realizar termociclado PCR. Mediante la aplicación de un gradiente de temperatura estática a través de una geometría del reactor se diseñan adecuadamente, un continuo flujo circulatorio se puede establecer que en repetidas ocasiones que el transporte a través de reactivos de PCR zonas de temperatura asociado a la desnaturalización, hibridación, y las fases de extensión de la reacción (Figura 1). Termociclado por lo tanto, se puede accionar de una manera pseudo-isotérmica simplemente sosteniendo dos superficies opuestas a una temperatura fija, eliminando la necesidad de calentar y enfriar repetidamente el instrumento. Uno de los principales desafíos que enfrenta el diseño de termocicladores convección es la necesidad de controlar con precisión la velocidad espacial y distribución de la temperatura dentro del reactor para asegurarse de que los reactivos de forma secuencial ocupan las zonas de temperatura correcta para un período de tiempo suficiente 10,11. A continuación se describen los resultados de nuestros esfuerzos para investigar el 3-D y la velocidad de distribución de la temperatura en el micro de convección termocicladores 12. Inesperadamente, se ha descubierto un subconjunto de las trayectorias de flujo de complejos que son muy favorables para PCR debido a una combinación sinérgica de (1) intercambio continuo entre las líneas de flujo que ofrece una mayor oportunidad para los reactivos para probar toda la gama de perfiles de temperatura óptima, y ​​( 2) aumento del tiempo dedicado en la zona de temperatura de extensión de la limitación de velocidad de paso de la PCR. Extremadamente rápidos tiempos de amplificación de ADN (de menos de 10 min) se pueden conseguir en los reactores diseñados para generar esos flujos.

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Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Se describe un nuevo método para llevar a cabo la replicación del ADN a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Convección térmica se aprovecha de los reactivos de transporte continuo entre la desnaturalización, hibridación, extensión y condiciones por el mantenimiento de las superficies opuestas del reactor a temperatura constante. Este diseño inherentemente simples promesas para hacer un rápido PCR más accesible.

PCR rápido ciclo térmico con convección térmica microescala

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

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Research

JoVE Journal

Biology

22.6K vistas.  Texas A&M University. Se describe un nuevo método para llevar a cabo la replicación del ADN a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Convección térmica se aprovecha de los reactivos de transporte continuo entre la desnaturalización, hibridación, extensión y condiciones por el mantenimiento de las superficies opuestas del reactor a temperatura constante. Este diseño inherentemente simples promesas para hacer un rápido PCR más accesible.

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Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma&#039;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

Genotipificación rápida de tejido de ratón utilizando extracto-N-Amp tejido Sigma PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Investigación

Biología

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Cuantitativas PCR en tiempo real utilizando el Thermo Scientific Solaris qPCR ensayo

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Detección rápida homogénea de Ensayos Biológicos Usando el Sistema de modulación magnética biosensores

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Perfiles de Pre-micro ARN y microRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

La determinación de perfiles genéticos de expresión en C. elegans Utilización de microarrays y PCR en tiempo real

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

PCR optimizado basado en la detección de Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to humans through the bite of infected Ixodes ticks. The primary etiological agent in North America is Borrelia burgdorferi sensu stricto. As geographic risk regions expand, it is prudent to support robust surveillance programs that can measure tick infection rates, and communicate findings to clinicians, veterinarians, and the general public. The molecular technique of nested polymerase chain reaction (nPCR) has long been used for this purpose, and it remains a central, inexpensive, and robust approach in the detection of Borrelia in both ticks and wildlife. 
This article demonstrates the application of nPCR to tick DNA extracts to identify infected specimens. Two independent B. burgdorferi targets, genes encoding Flagellin B (FlaB) and Outer surface protein A (OspA), have been used extensively with this technique. The protocol involves tick collection, DNA extraction, and then an initial round of PCR to detect each of the two Borrelia-specific loci. Subsequent polymerase chain reaction (PCR) uses the product of the first reaction as a new template to generate smaller, internal amplification fragments. The nested approach improves upon both the specificity and sensitivity of conventional PCR. A tick is considered positive for the pathogen when inner amplicons from both Borrelia genes can be detected by agarose gel electrophoresis.

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Nested PCR is a sensitive, specific, and straightforward technique that can be applied to tick DNA extracts to probe for Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme disease. The initial PCR experiment uses gene-specific primers to generate long amplicons, which then become templates for a subsequent reaction using internal primers.

Detectar el Spirochete de la enfermedad de Lyme, Burgdorferi de Borrelia, de garrapatas mediante PCR anidado

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

Lipídico rápido gota protocolo de aislamiento utilizando un Kit de aislamiento de organelas bien establecidas

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...