著者は、このプロトコルを最適化する上で彼女の助けでティファニーチェリーに感謝したいと思います。この作品は、国立老化研究所（AG032320）だけでなく、健康なウィスコンシン州を進めることによって資金を供給された。

ホモジネートで始まる手続きの基本的な回路図は図1を参照してください。細胞抽出物の作成からCAM -結合タンパク質の溶出に要する時間は約6〜7時間です。 1。組織の準備<ol><li>目的の組換えタンパク質を発現するプラスミドを含有するウイルスと器官型海馬スライス（この例では、緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付きng）を注入し、組織が一晩タンパク質を発現することができます。 </li><li>ウイルス注射後約12〜18時間（ウイルス発現時間に応じて）、組織を収集するための準備。ペトリ皿に1mLの解剖バッファー（10mMのグルコース、4mmのKClを、26ミリメートルNaHCO3水溶液、233mMスクロース、5％CO 2 95％O 2でガス処刑さ5mMのMgCl 2を 、1mMのCaCl 2で 、0.1％フェノールレッドを、）を追加します。ペトリ皿に培養組織/インサートを移し、水没に挿入組織に2mLの解剖のバッファを追加します。 </li><li> Collec軽くメスを用いてインサート膜の自由な組織を掻きによるT器官型海馬組織（5〜10スライス）。特に関心のある特定の地域（例：CA1）を削除することもオプションです。反転パスツールピペットを用いて1.5ml微量遠心チューブに中断組織を転送する。 </li><li>解剖のバッファから別の組織への1分間に1,500 rcfで、サンプルを遠心分離します。慎重に吸引して上清を取り除く。ペレットを妨害しないことを確認してください。 </li><li>使用するスライスごとに、均質化緩衝液（150MMのNaCl、20mMのトリスpH7.5、1mMのDTT、1μg/mlのロイペプチン、1μg/mlのchemostatin、1μg/mlのアンチパイン、1μg/mlのペプスタチン、および1％トリトンXの30〜60μLの組織-100）とは、乳棒で十分にホモジナイズする。 </li><li>細胞残渣を除去するためには、10分1,100 rcfで、残りのホモジネートを遠心し、ペレットからの汚染を回避しながら慎重に吸引して上清を取り除く。 </li><li>入力のサンプル（サンプル1）として、上清の10％を取る。ステップ3で使用するためのCAM -セファロースビーズの調製中に氷の上の残りの上清を保存する。 </li></ol>注：ここで使用される組織は器官型海馬スライスです。ただし、1つ解離神経細胞やその他の細胞培養システムを使用することができます。このような場合には、適切な方法であなたの組織を収集した後、ステップ1.4から始まります。 2。プルダウン用のビーズの調製ビーズを扱うには、ビーズをサルベージし、チューブの両側に乾燥からビーズを防ぐことによって、反応の効率を最大化するために重要です。そのためには、それは解決策がすぐに遠心分離する前に、チューブの壁にビーズを湿らせることができます、彼らの側にしてチューブを回転させることが最善です。 <ol><li>各プルダウンのため、相対的にFLAで2 mlのマイクロチューブに懸濁カルモジュリン-セファロースビーズのピペット400μLあなたのインキュベーションの間のビーズを使用してソリューションの表面積との相互作用を最大化するためにT -底。 </li><li> 30秒21,000 RCFでビーズを遠心し、慎重に吸引して上清を取り除く。ビーズを邪魔しないようにしてください。 </li><li>ビーズを洗浄するためには、Ca 2プルダウンビーズ用+ - CaMの結合タンパク質および2mM EDTAを（既知のCa 2 +キレート剤）プルダウンするために使用されているものに2mMのCaCl 2のいずれかを含むそれぞれの均質化緩衝液100μLを加えるApoCaM結合タンパク質。ゆっくりと1分間に1,500 rcfで再びサスペンドビーズや遠心するチューブをタップします。慎重にビーズを邪魔しないことを確認し、吸引して上清を取り除く。 </li></ol>注：すべての吸引の手順については、それがビーズを除去することなく、溶液の除去を可能にするために微細な開口部を（例えば、ゲルローディングチップ）を持つピペットチップを使用することをお勧めします。 3。タンパク質のCAM -セファロース結合<ol><li>等量を含む二つの条件にして上清を分割する。あなたの条件に応じて、各2 mMの濃度にして上清にCaCl 2またはEDTAの適切な量を追加します。 </li><li>ステップ1.7から対応する均質化緩衝液で洗浄したビーズに上清を追加。穏やかに混合するためにチューブをタップします。 </li><li>シェーカーで3時間4℃でサンプルをインキュベートする。結合の効率性を高めるために毎30分ほどビーズを再懸濁する。 </li><li> 3分1,500 rcfで、サンプルとビーズを含むチューブを遠心する。 </li><li>非結合タンパク質のサンプル（サンプル2）として、上清の50μLを取り、慎重に吸引し、廃棄によって、残りの上清を取り除く。 </li><li>それぞれの均質化緩衝液の100μLを用いて、ステップ2.3で説明したようにビーズを3回洗浄する。 </li></ol> 4。溶出<ol><li>反対の条件（10mMのCを含む溶出バッファー（50mMトリス - 塩酸pH7.5の、および150mmのNaCl）の50μLを追加ビーズにACL 2または10mMのEDTA）。例えば、 カルシウムを含む緩衝液中でホモジナイズし、バインドされていたサンプルは+ EDTAおよびその逆を含む溶出バッファーで溶出されています。 </li></ol>オプション：° Cビーズに添加する前に37に溶出バッファーのウォーミングは、歩留まりを高めることができる。 <ol start="2"><li>シェーカーで30分間室温でビーズを備えたソリューションをインキュベートする。静かに5分ごとに約チューブをタップしてビーズを混ぜる。 </li><li> 3分1,500 rcfでビーズを遠心し、慎重に吸引によって結合タンパク質（サンプル3）のために上清の50μLを削除します。ビーズを邪魔しないようにしてください。 </li><li>すべてのサンプル（すなわちホモジネート、非結合および結合蛋白質だけでなく、それらはまだビーズに結合）するタンパク質のローディングバッファーを追加。 </li></ol>注：、（特に非効率的な溶出の場合）溶出を最大限に対応する溶出バッファー（EDTAを含む、bufを追加するなどの50μLを追加する残りの結合蛋白質と、残りの結合タンパク質を除去するために4.3で説明した手順を繰り返しますを溶出するためのサンプルを加熱する前に、ビーズに）のCaCl 2にバインドされているビーズのFER。 5。 SDS - PAGEおよびウェスタンブロット SDS - PAGEを行い、陽性対照として、反対の条件でCAMを結合することが知られているタンパク質の関心とプローブのタンパク質に対するプロービングによるウェスタンブロットを用いて分析する。 6。代表的な結果図2Bは、内因性の呉に比べてGFP -タグ付き呉のCAMの結合をテストするのCaM -プルダウンアッセイの例を示しています。そのためには、GFP - NGは一晩私たちの器官型海馬切片において過剰発現され、組織をホモジナイズした。ホモジネートを、Ca 2 +またはEDTAのいずれかの存在下でカルモジュリン-セファロースビーズとインキュベートした。ホモジネート入力は、GFP - NGは、内因性NgとのCa 2 + /カルモジュリン依存性キナーゼIIに加えて、発現していることを示しています。（CaMKII）。として内因性NG（図2Aに示す）の既知の結合に基づいて予想される、呉はCa 2 +（EDTA結合タンパク質）の有無およびCa 2 +の存在下で結合していない（図2B）で溶出されたGFPタグ。対照的に、制御、CaMKIIは、唯一のCa 2 +（結合タンパク質）の存在下で溶出され、その不在（EDTA）にバインドされていないていた。これは、CAMのビーズが正しく機能していたと溶出が効率的であったことを示しています。最も重要なことは、GFP - ngは内因性のフォームに類似した方法でApoCaMに結合することをこのショーは、GFPタグが私たちの組換えタンパク質の機能を変化させなかったことを示唆している。 <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig1.jpg" alt="図1"/> CaMとプルダウンアッセイの図1。概要 （A）組織ホモジネートは、細胞残渣を除去するためにスピンダウンされています。上清の約10％は、入力のサンプル（1）として取られます。残りの上清を別のために均等に分割されます条件と適切な試薬（CaCl 2またはEDTA）は、これらの条件で結合テストするために追加されます。 （CaCl 2またはEDTAのいずれかを含む）それぞれの上清には、それぞれ準備のCaM -セファロースビーズにロードされ、（B）結合できるようにインキュベートされる。未結合のタンパク質は削除されます（2）及び（C）結合蛋白質（3）結合として反対の条件を含む溶出バッファー（EB）を使用してビーズのオフ溶出される。これら3つのタンパク質試料のタンパク質組成はSDS - PAGEおよびウェスタンブロット分析を用いて分析することができます。 <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig2.jpg" alt="図2"/> 図2 A.）プルダウンアッセイの例ではCa 2 +依存性のCaMの結合と溶出の回路図は、Ca 2 +依存的にタンパク質の2種類のそのバインドCAMの与えられている。ニューログラニン（Ngは）バインドAPO - CaMとCaMKIIは、Ca 2 + -リッチに結合するタンパク質を表しているタンパク質を表しますカルモジュリン。 CAMは、ホモジネートのタンパク質とのインキュベーションに先立って、その解離状態で表示されます。一度高いCa 2 +濃度（2mM）をの条件下でインキュベートまたはCa 2 +キレート剤、EDTA（2mMの）の存在下で、タンパク質は、それに応じてCAMにバインドします。 NgはないのCa 2 +現在はほとんどがあるとしてEDTAの条件でCAMを結合し、Ca 2 +の存在下でのCaM -セファロースビーズから溶出される。 CaMKIIは、しかし、 カルシウムの多量の存在下でCAMにバインドします+とCa 2 +をキレート化された後に解離するでしょう。 B.）例CaMとプルダウンアッセイの結果。この図は、CAM -セファロースの予想される最終結果サンプルNgとCaMKII用プローブでプルダウンを示しています。内因性NgとGFP - NGの両方は、EDTAの存在下でCAMに結合したタンパク質のレーンに存在する。サンプルはそのNを示す、Ca 2 +の存在下でカルモジュリンとインキュベートしているときにンがバインドされgは唯一のアポ- CAMをバインドします。私たちのポジティブコントロール、CaMKIIは、その一方で、唯一のCa 2 +の存在下でカルモジュリンと結合する。

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	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin,+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein.">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li><li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+(RC3+protein,+neurogranin)+from+rat+brain.">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li><li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif.">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li><li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth.">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction.">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li><li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

提供するプロトコルは、CAM -結合蛋白質のCa 2 + -依存性を調査するようにCAM -セファロースビーズを利用しています。多くのタンパク質は、Ca 2 +依存的にカルモジュリンを結合する。これらの相互作用は、多くのシグナル伝達経路におけるカルモジュリン結合タンパク質およびそれらの重要な役割の数は与えられた非常に重要です。このプロトコルでは、CAM -セファロースビー?...

<table border="1"><tr><td> 製品 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> ノート </td></tr><tr><td>カルモジュリンセファロースビーズ</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td>アンチCamKIIアルファ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td>抗ニューログラニン</td><td>ミリポア</td><td> 07から425 </td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディングピペットチップ</td><td>フィッシャー</td><td> 02-707-138 </td><td>上清の吸引のために使用します。 </td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ（2.0 mL）を</td><td>フィッシャー</td><td> 05-408-146 </td><td>カルモジュリン-セファロースビーズを含むすべてのステップのために使用します。 </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

カルシウム（Ca 2 +）は、さまざまなメカニズムを通じて細胞機能の調節に重要なイオンで ​​す。多くのCa 2 +のシグナリングは、カルモジュリン（CaM）1,2として知られているカルシウム結合タンパク質によって媒介される。 CAMは、アポトーシス、代謝、平滑筋収縮、シナプス可塑性、神経の成長、炎症と免疫応答を含むほぼすべての細胞プロセス、内の複数のレベルで関与している。タンパク質の数は、CAMとの相互作用を介してこれらの経路を調節するのに役立ちます。これらの相互作用の多くは、Ca 2にバインドされたときに明らかに異なっているCAMのコンフォメーション、+（のCa 2 + - CaMの）としてのCa 2 + -フリー状態（ApoCaM）3とは対照的に依存する。 ほとんどの標的タンパク質は、Ca 2 + - CaMのをバインドしながら、特定のタンパク質だけApoCaMに結合する。ニューロ4、ニューログラニン（呉）5、および特定のミオシンを含む彼らのIQ -ドメインを介して、いくつかのバインドCAM、 <sup&gt; 6。これらのタンパク質はそれぞれ、前シナプス機能7、シナプス機能8、および筋収縮9の重要な役割を果たすことが示されている。結合し、Ca 2 +の存在下または存在下でCAMをリリースする+能力は、それらの機能に極めて重要である。対照的に、多くのタンパク質は唯一のCa 2 + - CaMの結合し、それらの活性化のため、このバインディングを必要とする。例としては、ミオシン軽鎖キナーゼ10のCa 2 + /カルモジュリン依存性キナーゼ（CaMKs）11とホスファターゼ（例えばカルシニューリン）12、及び直接的および下流効果14のバリエーションがスペクトリンキナーゼ13を 、含まれています。 細胞機能に対するこれらのタンパク質の効果は、通常のCa 2 +依存的にCAMに結合する能力に依存しています。例えば、我々は、シナプス機能とどのように異なる突然変異は、この結合に影響を与えるのNG - CaMの結合の妥当性をテストした。我々は、GFPタグ付き伍CONを生成のCa 2 +依存的にCAMをバインドするために呉の能力を変更するようなIQ -ドメイン内の特定の変異を持つ構造体。これらの異なる突然変異の研究は、シナプス機能8,15に関与する重要なプロセスに私たちに偉大な洞察力を与えた。しかし、このような研究で、それは変異タンパク質が予想されるのCaMへの結合を変更していることを証明するために不可欠です。 ここで、我々は、例としてCaMKIIとngを使用して、Ca 2 +の存在下または非存在下でCAMに結合するタンパク質の能力をテストするための手法を提案する。このメソッドは、CaMとプルダウンアッセイと呼ばれるアフィニティークロマトグラフィーの形です。それは、CaMと+この結合に対するCa 2 +の影響に結合するタンパク質をテストするためのCaM -セファロースビーズを使用しています。それは、効率的なかなり多くの時間であり、カラムクロマトグラフィーおよび他のアッセイの相対少ない蛋白質を必要とします。完全に、これはでているのCa 2 + /カルモジュリンのシグナル伝達やタンパク質を探索するために貴重なツールを提供します。CAMとteract。

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Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

カルモジュリン（CaM）プルダウンアッセイは、様々なタンパク質とカルモジュリンの相互作用を調査するために効果的な方法です。このメソッドは、CAM -結合タンパク質の効率的かつ特定の分析のためのCaM -セファロースビーズを使用しています。これは、細胞機能のCAM信号を探索するための重要なツールが用意されています。

プルダウンカルモジュリン結合タンパク質の

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Research

JoVE Journal

Biology

25.2K ビュー.  Medical College of Wisconsin. カルモジュリン（CaM）プルダウンアッセイは、様々なタンパク質とカルモジュリンの相互作用を調査するために効果的な方法です。このメソッドは、CAM -結合タンパク質の効率的かつ特定の分析のためのCaM -セファロースビーズを使用しています。これは、細胞機能のCAM信号を探索するための重要なツールが用意されています。

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Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

タンパク質の電気泳動分離

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

生物学

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

ゲルでタンパク質を染色

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

細胞生物学のためのタンパク質のマイクロコンタクトプリンティング

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

天然のタンパク質からアミロイドの迅速な生成<em&gt;インビトロ</em

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

マウスにおける流体力学的遺伝子送達によるタンパク質の一過性発現

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

多重化アプリケーションのための蛍光タンパク質との遺伝バーコーディング

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).