Die Autoren bedanken sich bei Tiffany Cherry in ihre Hilfe bei der Optimierung dieses Protokoll. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Aging (AG032320) sowie Weiterentwicklung einer gesünderen Wisconsin finanziert.

Siehe Abbildung 1 für eine Prinzipskizze des Verfahrens, beginnend mit dem Homogenat Abbildung. Geschätzte Zeit von der Vorbereitung der zellulären Extrakte Elution von CaM-Proteine ​​ist ca. 6-7 Stunden. 1. Tissue Vorbereitung <ol><li> Inject organotypischen Schnitten des Hippocampus mit einem Virus mit einem Plasmid, das rekombinante Protein von Interesse (in diesem Beispiel grün fluoreszierende Protein (GFP)-markierten Ng) und erlauben Gewebe Protein Nachtexpress. </li><li> Etwa 12 bis 18 Stunden nach der viralen Injektion (in Abhängigkeit von der viralen Ausdruck der Zeit), vorzubereiten, um das Gewebe zu sammeln. 1ml dissection-Puffer (10 mM Glukose, 4mm KCl, 26mm NaHCO3, 233mm Saccharose, 5 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2 und 0,1% Phenol-rot, vergast mit 5% CO 2 95% O 2) in eine Petrischale. Transfer gezüchtetes Gewebe / einfügen, um Petrischale und fügen 2mL Dissektion Puffer, um den Einsatz zu versenken das Gewebe. </li><li> Collectiont organotypischen hippokampalen Gewebe (zwischen 5 und 10 Scheiben) durch vorsichtiges Schaben das Gewebe frei von dem Einsatz Membran mit einem Skalpell. Insbesondere das Entfernen einer bestimmten Region von Interesse (zB CA1) ist auch eine Option. Übertragen Sie die suspendierten Gewebes auf eine 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit einem umgekehrten Pasteur-Pipette. </li><li> Centrifuge Proben bei 1.500 rcf für 1 min, um Gewebe aus der Zerlegung Puffer zu trennen. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen. Achten Sie darauf, das Pellet zu stören. </li><li> Für jede Scheibe verwendet, fügen Sie 30 bis 60 ul Homogenisationspuffer (150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 1 mM DTT, 1μg/mL Leupeptin 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL Antipain, 1μg/mL Pepstatin und 1% Triton X -100), um das Gewebe und gründlich homogenisieren mit Pistill. </li><li> Um Zelltrümmer zu entfernen, Zentrifuge die restlichen Homogenat bei 1.100 rcf für 10 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen, während Vermeidung von Kontaminationen aus dem Pellet. </li><li> Nehmen Sie sich 10% der Überstand als Probe des Eingangs (Probe 1). Bewahren Sie die verbleibende Überstand auf Eis bei der Herstellung der CaM-Sepharose-Kügelchen für den Einsatz in Schritt 3 fort. </li></ol> Hinweis: Das Gewebe hier verwendeten organotypischen Schnitten des Hippocampus. Allerdings könnte man dissoziierten Neuronen oder anderen Zellkultur-System. In einem solchen Fall bei Schritt 1.4 beginnen, nachdem der Erhebung Ihrer Gewebe in geeigneter Weise. 2. Vorbereitung von Perlen für Pull-Down- Im Umgang mit den Perlen ist es wichtig, die Perlen zu bergen und zu maximieren die Effizienz der Reaktionen durch die Verhinderung der Perlen aus dem Trocknen auf den Seiten des Rohres. Dazu ist es am besten zu Ihrem Rohre auf ihrer Seite drehen, sodass Lösung für die Perlen an den Wänden der Röhre nass, unmittelbar vor dem Zentrifugieren. <ol><li> Für jeden Pull-Down-, Pipette 400 ul ausgesetzt Calmodulin-Sepharose Kügelchen in ein 2 ml Reaktionsgefäß mit einem relativ flat-bottom, um die Oberfläche und die Interaktion Ihrer Lösungen mit den Kügelchen während Inkubationen maximieren. </li><li> Centrifuge Perlen mit 21.000 rcf für 30 Sekunden und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen. Achten Sie darauf, die Perlen zu stören. </li><li> Zum Waschen der Kügelchen, 100 l der jeweiligen Homogenisierungspuffer mit entweder 2 mM CaCl 2 zu denen, die verwendet werden, um Pull-Down-Ca 2 +-CaM bindende Proteine ​​und 2 mM EDTA (ein bekannter Ca 2 +-Chelator) für Perlen Herunterziehen ApoCaM bindenden Proteinen. Klopfen Sie leicht das Rohr wieder auszusetzen Perlen und Zentrifuge bei 1.500 rcf für 1 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen, was sicher nicht zu den Perlen zu stören. </li></ol> Hinweis: Für alle die Sehnsucht Stufen, empfiehlt es sich, eine Pipettenspitze, dass eine feine Öffnung (z. B. Gel-loading Tips), um das Entfernen der Lösung ohne Entfernen Perlen ermöglichen verfügt. 3. CaM-Sepharose Bindung von Proteinen <ol><li> Teilen Sie Ihre Überstand in zwei Bedingungen, die ein gleiches Volumen. Abhängig von Ihrem Zustand, fügen Sie die entsprechende Menge an CaCl 2 oder EDTA Ihre Überstand bis zu 2 mM Konzentration für jeden. </li><li> Add Überstand aus Schritt 1,7 bis Perlen in entsprechende Homogenisierung Puffer gewaschen. Klopfen Sie leicht das Rohr zu mischen. </li><li> Inkubieren Proben bei 4 ° C für 3 Stunden auf einem Schüttler. Re-suspend Perlen alle 30 min oder so, um die Effizienz der Bindung zu erhöhen. </li><li> Zentrifugenröhrchen mit Proben und Perlen bei 1.500 rcf für 3 min. </li><li> Nehmen Sie 50 ul Überstand als Probe des ungebundenen Protein (Probe 2) und entfernen Sie vorsichtig die restlichen Überstände durch Absaugen entfernen und entsorgen. </li><li> Wash Perlen drei Mal so in Schritt 2.3 mit 100 &amp;mgr; l der jeweiligen Homogenisierungspuffer beschrieben. </li></ol> 4. Elution <ol><li> Add 50 ul Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5 und 150 mM NaCl) mit den entgegengesetzten Zustand (10 mM CACL 2 oder 10mm EDTA), um die Perlen. Zum Beispiel, Proben, homogenisiert und in einem Puffer mit Ca 2 + gebunden waren in Elutionspuffer mit EDTA und umgekehrt eluiert. </li></ol> Optional: Warming der Elutionspuffer auf 37 ° C vor der Zugabe zu Kügelchen können die Ausbeute zu erhöhen. <ol start="2"><li> Inkubieren Lösung mit Perlen bei Raumtemperatur für 30 min auf einem Schüttler. Mischen Sie die Perlen durch leichtes Antippen des Röhrchens etwa alle 5 min. </li><li> Centrifuge Perlen bei 1.500 rcf für 3 min und entfernen Sie vorsichtig das 50 ul Überstand für das gebundene Protein (Probe 3) durch Aspiration. Achten Sie darauf, die Perlen zu stören. </li><li> Add-Protein-Ladepuffer für alle Proben (dh Homogenat, ungebundenen und gebundenen Proteins sowie diejenigen, die noch an die Kügelchen gebunden). </li></ol> Hinweis: Um Elution (besonders im Fall von ineffizienten Elution) zu maximieren, fügen Sie 50 ul der entsprechenden Elutionspuffer (zB Zugabe von EDTA mit buffer, um die Kügelchen in CaCl 2 gebunden), um die Perlen vor der Erwärmung Proben zu helfen eluieren alle verbleibenden gebundenen Proteins und wiederholen Sie die Schritte in 4.3 beschrieben, um die verbleibenden Proteine ​​zu entfernen. 5. SDS-PAGE und Western-Blot Conduct SDS-PAGE und analysieren mit Western-Blot durch Sondierung für Ihr Protein von Interesse und Sonde für ein Protein bekannt, CaM in die entgegengesetzte Zustand als eine positive Kontrolle zu binden. 6. Repräsentative Ergebnisse 2B zeigt ein Beispiel einer CaM-pull-down-Assay Test des CaM Bindung von GFP-markierten Ng gegenüber endogenen Ng. Dazu wurde GFP-Ng in unserem organotypischen Schnitten des Hippocampus über Nacht und überexprimiert wurde das Gewebe homogenisiert. Das Homogenat wurde mit CaM-Sepharose-Kügelchen in Anwesenheit von entweder Ca 2 + oder EDTA inkubiert. Homogenat Eingang zeigt, dass die GFP-Ng neben endogenen Ng und Ca 2 + / CaM-abhängige Kinase II exprimiert wurde(CaMKII). Als Basis der bekannten Bindung des endogenen Ng (dargestellt in Abb.. 2A) erwartet, GFP-markierten Ng in der Abwesenheit von Ca 2 + (EDTA gebundenen Proteins) und ungebundenen in Gegenwart von Ca 2 + (Abb. 2B) eluiert . Im Gegensatz dazu war die Kontrolle, CaMKII, nur in Gegenwart von Ca 2 + (gebundene Protein) eluiert und ungebunden in seiner Abwesenheit (EDTA). Dies zeigt, dass die CAM-Perlen wurden ordnungsgemäß funktioniert und die Elutionen waren effizient. Vor allem, was darauf hindeutet dies zeigt, dass GFP-Ng bindet in ähnlicher Weise wie die endogene Form ApoCaM, dass die GFP-Tag hatte keinen Einfluss auf die Funktion unserer rekombinanten Proteins. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Überblick über die CaM Pull-Down-Assay (A) Gewebehomogenat wird auf Zelltrümmer zu entfernen gesponnen. Über 10% der Überstand wird als ein Beispiel für die Eingabe (1) übernommen. Der verbleibende Überstand wird ebenso für die verschiedenen geteiltBedingungen und die entsprechenden Reagenzien (CaCl 2 oder EDTA) zugegeben, um Tests in diesen Bedingungen verbindlich. Jeder Überstand (enthält entweder CaCl 2 oder EDTA) wird auf den jeweils vorbereitet CaM-Sepharose-Kügelchen geladen und (B) inkubiert, damit verbindlich. Ungebundene Proteine ​​entfernt werden (2) und (C) die gebundenen Proteine ​​(3) sind aus der Perlen mit Elutionspuffer (EB) mit dem entgegengesetzten Zustand, wie die Bindung eluiert. Die Protein-Zusammensetzung dieser drei Protein-Proben können analysiert mit SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. A.) Schematische Darstellung der Ca 2 +-abhängige CaM Bindung und Elution in Pull-Down-Assay Beispiele sind zwei Arten von Protein binden CaM in einem Ca 2 +-abhängigen Weise gegeben. Neurogranin (Ng) stellt Proteine ​​binden apo-Cam und CaMKII Proteine, die Ca 2 +-reiche binden stelltCaM. CaM ist in seiner dissoziierten Zustand vor der Inkubation mit dem Homogenat Proteine ​​gezeigt. Einmal unter den Bedingungen hoher Ca 2 +-Konzentrationen (2 mM) oder in Gegenwart eines Ca 2 +-Chelator inkubiert, EDTA (2 mM), die Proteine ​​werden CaM entsprechend zu binden. Ng bindet CaM in der EDTA-Zustand, da es wenig bis gar keine Ca 2 + vorhanden ist, und würde ausgeschaltet werden die CaM-Sepharose-Kügelchen in Anwesenheit von Ca 2 + eluiert. CaMKII, würde jedoch zu CaM in Gegenwart von hohen Mengen an Ca 2 + binden und würde distanzieren, wenn die Ca 2 + wurde Chelat. B.) Die Ergebnisse aus Beispiel CaM Pull-Down-Assay. Diese Abbildung zeigt die erwartete Endergebnis einer CaM-Sepharose-Pulldown mit den Proben untersucht, um Ng und CaMKII. Sowohl die endogene Ng und GFP-Ng sind in den Gassen von Proteinen gebunden CaM in Gegenwart von EDTA. Keine Ng gebunden ist, wenn die Proben mit CaM in Gegenwart von Ca 2 + inkubiert werden, die zeigen, dass Ng bindet nur apo-Cam. Unsere positive Kontrolle, CaMKII, auf der anderen Seite, bindet an CaM nur in Gegenwart von Ca 2 +.

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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die zur Verfügung gestellten Protokoll verwendet CaM-Sepharose-Kügelchen, die Ca 2 +-Abhängigkeit der CaM-bindenden Proteinen zu untersuchen. Viele Proteine ​​binden CaM in einem Ca 2 +-abhängigen Weise. Diese Wechselwirkungen sind von großer Bedeutung angesichts der Zahl der CaM-bindende Proteine ​​und ihre entscheidende Rolle in vielen Signalwegen. In diesem Protokoll werden CaM-Sepharose-Kügelchen verwendet, um CaM-bindenden Proteinen aus Gewebehomogenat separaten in die Gegenwart ...

<table border="1"><tr><td> Produkt </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Hinweise </td></tr><tr><td> Calmodulin-Sepharose beads </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CaMKII alpha </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Loading Pipettenspitzen </td><td> Fischer </td><td> 02-707-138 </td><td> Verwenden Sie zum Absaugen der Überstände </td></tr><tr><td> Reaktionsgefäße (2,0 ml) </td><td> Fischer </td><td> 05-408-146 </td><td> Verwenden Sie für alle Schritte mit Calmodulin-Sepharose-Kügelchen </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

Calcium (Ca 2 +) ist ein Ion wichtig bei der Regulation zellulärer Funktionen durch eine Vielzahl von Mechanismen. Ein Großteil der Ca 2 +-Signalisierung wird durch die Calcium-bindende Protein als Calmodulin (CaM) 1,2 bekannt vermittelt. CaM ist auf mehreren Ebenen in fast allen zellulären Prozessen, einschließlich Apoptose, Metabolismus, Kontraktion der glatten Muskulatur, die synaptische Plastizität, nerve growth, Entzündungen und der Immunantwort beteiligt. Eine Reihe von Proteinen zu regulieren diese Wege durch ihre Interaktion mit CaM. Viele dieser Wechselwirkungen hängen von der Konformation des CaM, die deutlich anders ist als an Ca 2 + (Ca 2 +-CaM) an seiner Ca 2 +-freien Zustand (ApoCaM) 3 gegenüber gebunden. Während die meisten Zielproteine ​​binden Ca 2 +-CaM, bestimmte Proteine ​​binden nur an ApoCaM. Einige binden CaM durch ihre IQ-Domäne, einschließlich neuromodulin 4, neurogranin (Ng) 5, und bestimmte Myosin <sup&gt; 6. Diese Proteine ​​haben gezeigt, dass eine wichtige Rolle in präsynaptischen Funktion 7, postsynaptische Funktion 8 und Muskelkontraktion 9 Spielen jeweils. Ihre Fähigkeit zur Bindung und Freisetzung CaM in der Abwesenheit oder Anwesenheit von Ca 2 + ist von zentraler Bedeutung in ihrer Funktion. Im Gegensatz dazu viele Proteine ​​binden nur Ca 2 +-CaM und benötigen diese Bindung für ihre Aktivierung. Beispiele hierfür sind Myosin Light Chain Kinase 10, Ca 2 + / CaM-abhängigen Kinasen (CaMKs) 11 und Phosphatasen (zB Calcineurin) 12, und Spektrin Kinase 13, die eine Vielzahl von direkten und nachgelagerten Auswirkungen 14 aufweisen. Die Auswirkungen dieser Proteine ​​auf die zelluläre Funktion sind oft abhängig von ihrer Fähigkeit, an CaM in einem Ca 2 +-abhängigen Weise zu binden. Zum Beispiel haben wir getestet, die Relevanz der Ng-CaM Bindung in synaptische Funktion und wie verschiedene Mutationen dieser Bindung beeinflussen. Wir erzielten ein GFP-markierten Ng construct mit spezifischen Mutationen in den IQ-Domäne, die die Fähigkeit des Ng zu CaM in einem Ca 2 +-abhängigen Weise zu binden verändern würde. Die Untersuchung dieser verschiedenen Mutationen gab uns einen großartigen Einblick in wichtige Prozesse der synaptischen Funktion 8,15 beteiligt. Doch in solchen Studien ist es wichtig zu zeigen, dass die mutierten Proteine ​​der erwarteten veränderten Bindung an CaM haben. Hier stellen wir ein Verfahren zur Prüfung der Fähigkeit von Proteinen an CaM in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Ca 2 + binden, mit CaMKII und Ng als Beispiele. Diese Methode ist eine Form der Affinitätschromatographie bezeichnet als CaM Pull-Down-Assay. Es nutzt CaM-Sepharose Perlen Proteine, die an CaM und den Einfluss der Ca 2 + auf diese Bindung binden zu testen. Es ist wesentlich mehr Zeit effizienter und erfordert weniger Protein relativ zur Säulenchromatographie und andere Assays. Insgesamt bietet diese zu einem wertvollen Werkzeug zur Ca 2 + / CaM-Signalisierung und Proteine, die in erkundenteract mit CaM.

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Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calmodulin (CaM) Pull-Down-Assay ist ein effektiver Weg, um die Interaktion von CaM mit verschiedenen Proteinen zu untersuchen. Diese Methode verwendet CaM-Sepharose-Kügelchen für eine effiziente und spezifische Analyse von CaM-bindenden Proteinen. Dies stellt ein wichtiges Instrument zur CaM-Signalisierung in zelluläre Funktion zu erforschen.

Pull-down von Calmodulin-bindende Proteine

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Research

JoVE Journal

Biology

25.3K Aufrufe.  Medical College of Wisconsin. Calmodulin (CaM) Pull-Down-Assay ist ein effektiver Weg, um die Interaktion von CaM mit verschiedenen Proteinen zu untersuchen. Diese Methode verwendet CaM-Sepharose-Kügelchen für eine effiziente und spezifische Analyse von CaM-bindenden Proteinen. Dies stellt ein wichtiges Instrument zur CaM-Signalisierung in zelluläre Funktion zu erforschen.

Serie: Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Elektrophoretische Trennung von Proteinen

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Forschung

Biologie

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Die Färbung Proteine ​​in Gelen

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Mikrokontaktdrucken von Proteinen für Zellbiologie

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Transiente Expression von Proteinen durch Hydrodynamische Gentransfer in Mäusen

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immundetektion von Außenmembranproteinen mittels Durchflusszytometrie von isolierten Mitochondrien

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).