Les auteurs tiennent à remercier Tiffany cerise dans son aide à l&#39;optimisation de ce protocole. Ce travail a été financé par l&#39;Institut national du vieillissement (AG032320) ainsi que l&#39;avancement une meilleure santé du Wisconsin.

Reportez-vous à la Figure 1 pour un schéma de base de la procédure depuis le broyat. Estimation du temps de la préparation d&#39;extraits cellulaires à élution de protéines liées CaM est d&#39;environ six à sept heures. 1. Préparation des tissus <ol><li> Injecter organotypiques coupes d&#39;hippocampe par un virus contenant un plasmide exprimant la protéine recombinante d&#39;intérêt (dans cet exemple, la protéine fluorescente verte (GFP)-taggés Ng) et permettent d&#39;exprimer des protéines des tissus pendant la nuit. </li><li> Environ 12 à 18 heures après l&#39;injection virale (selon le temps d&#39;expression viral), se préparent à recueillir les tissus. Ajouter 1ml de tampon de dissection (glucose 10 mM, 4mm KCl, NaHCO3 26mm, 233mm de sucrose, 5 mM MgCl 2, CaCl 2 1mM, et 0,1% de phénol-rouge, gazés avec 5% de CO 2 de 95% O 2) pour une boîte de Pétri. Transfert de cultures de tissus / insert pour boîte de Pétri et ajouter du tampon de dissection 2mL à l&#39;insertion de submerger le tissu. </li><li> Collect organotypiques de tissu hippocampique (entre 5 et 10 tranches) en grattant doucement le tissu libre de la membrane d&#39;insérer à l&#39;aide d&#39;un scalpel. Plus précisément enlever une région d&#39;intérêt particulier (par exemple CA1) est également une option. Transfert des tissus suspendus à un tube à centrifuger de 1,5 ml en utilisant une pipette Pasteur inversé. </li><li> Centrifuger les échantillons à 1.500 rcf pendant 1 min pour séparer les tissus provenant de la mémoire tampon de la dissection. Retirez délicatement le surnageant par aspiration. Veillez à ne pas perturber le culot. </li><li> Pour chaque tranche utilisée, ajouter 30 à 60 uL de tampon d&#39;homogénéisation (150mm de NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 1 mM de DTT, 1μg/mL leupeptine, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL antidouleur, pepstatine 1μg/mL, et 1% de Triton X -100) au tissu et homogénéiser soigneusement avec un pilon. </li><li> Afin d&#39;éliminer les débris cellulaires, centrifuger l&#39;homogénat restant à 1100 rcf pendant 10 min et retirez soigneusement le surnageant par aspiration, tout en évitant la contamination par le culot. </li><li> Prenez 10% de surnageant comme un échantillon de l&#39;entrée (échantillon 1). Stocker le surnageant restant sur la glace pendant la préparation des billes de CaM-sépharose pour une utilisation à l&#39;étape 3. </li></ol> Remarque: Le tissu utilisé ici sont organotypiques coupes d&#39;hippocampe. Toutefois, on pourrait utiliser des neurones dissociés ou toute autre cellule du système de culture. Dans un tel cas, commencer à l&#39;étape 1.4, après la collecte de vos tissus de la manière appropriée. 2. Préparation des billes pour les pull-down Dans la manipulation des perles, il est important de récupérer les perles et de maximiser l&#39;efficacité des réactions en empêchant les perles de sécher sur les parois du tube. Pour ce faire, il est préférable de faire tourner vos tubes de leur côté, permettant solution pour mouiller les perles sur les parois du tube, immédiatement avant la centrifugation. <ol><li> Pour chaque menu déroulant, une pipette 400 pi de suspension calmoduline-sépharose billes dans un microtube de 2 mL avec un fla relativementT-bas pour maximiser la surface et l&#39;interaction de vos solutions avec les perles pendant votre incubations. </li><li> Centrifugeuse à 21000 rcf perles pendant 30 secondes et retirer délicatement le surnageant par aspiration. Assurez-vous de ne pas déranger les perles. </li><li> Pour laver les perles, ajouter 100 ul du tampon d&#39;homogénéisation respectifs contenant soit 2 mM de CaCl2 à ceux qui sont utilisés pour tirer vers le bas Ca 2 +-CaM protéines de liaison et 2 mM d&#39;EDTA (un chélateur connue Ca 2 +) pour les perles tirant vers le bas protéines ApoCaM contraignant. Tapoter légèrement le tube pour remettre en suspension des perles et centrifuger à 1500 rcf pendant 1 min. Retirez délicatement le surnageant par aspiration, en veillant à ne pas perturber les perles. </li></ol> Note: Pour toutes les étapes d&#39;aspiration, il est recommandé d&#39;utiliser un embout de pipette qui a une ouverture fine (par exemple des conseils de chargement de gel) pour permettre le retrait de la solution sans avoir à retirer des perles. 3. CaM-sépharose liaison des protéines <ol><li> Divisez votre surnageant dans deux conditions contenant un volume égal. Selon votre condition, ajouter la quantité appropriée de CaCl 2 ou de l&#39;EDTA à votre surnageant jusqu&#39;à 2 mM de concentration pour chacun. </li><li> Ajouter surnageant de l&#39;étape de 1,7 à billes lavées en tampon d&#39;homogénéisation correspondante. Tapoter légèrement le tube pour mélanger. </li><li> Incuber les échantillons à 4 ° C pendant 3 heures sur un agitateur. Re-suspendre des perles toutes les 30 min environ pour accroître l&#39;efficacité de la liaison. </li><li> Tube à centrifuger contenant des échantillons et des perles à 1.500 rcf pendant 3 min. </li><li> Prenez 50 pl de surnageant comme un échantillon de protéine non liée (échantillon 2) et retirer délicatement le surnageant restant par aspiration et le jeter. </li><li> Lavez perles trois fois comme décrit dans l&#39;étape 2.3 en utilisant 100 pi de tampon d&#39;homogénéisation respectifs. </li></ol> 4. Élution <ol><li> Ajouter 50 pl de tampon d&#39;élution (50 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl et 150 mm) contenant la condition opposée (10 mM CACL 2 ou 10mm EDTA) aux billes. Par exemple, les échantillons qui ont été homogénéisés et lié dans un tampon contenant Ca 2 + sont élués dans le tampon d&#39;élution contenant de l&#39;EDTA et vice-versa. </li></ol> En option: le réchauffement du tampon d&#39;élution à 37 ° C avant d&#39;ajouter à billes peuvent améliorer le rendement. <ol start="2"><li> Incuber solution avec des perles à la température ambiante pendant 30 min sur un agitateur. Mélanger les perles en tapotant délicatement le tube environ toutes les 5 min. </li><li> Centrifuger à 1500 fcr perles pendant 3 min et retirez délicatement le 50 pl de surnageant pour la protéine liée (échantillon 3) par aspiration. Assurez-vous de ne pas déranger les perles. </li><li> Ajouter tampon de chargement de protéines pour tous les échantillons (c.-à homogénat, traitées et non traitées des protéines ainsi que ceux qui sont encore lié aux billes). </li></ol> Remarque: Afin de maximiser l&#39;élution (en particulier dans le cas d&#39;élution inefficace), ajouter 50 pl du tampon d&#39;élution correspondant (par exemple en ajoutant EDTA buf contenantFer à perles liés au CaCl 2) aux billes avant de chauffer les échantillons pour aider à éluer toutes les protéines restant liés et répétez les étapes décrites à la section 4.3 pour enlever les protéines liées. 5. SDS-PAGE et Western blot Conduite SDS-PAGE et Western blot en utilisant l&#39;analyse par sondage pour votre protéine d&#39;intérêt et de la sonde pour une protéine connue pour se lier CAM dans la condition opposée comme un contrôle positif. 6. Les résultats représentatifs La figure 2B représente un exemple d&#39;un dosage de la CaM-pull-down test de la liaison de la CaM de GFP-Ng marqués par rapport à Ng endogène. Pour ce faire, GFP-Ng a été surexprimé dans notre organotypiques coupes d&#39;hippocampe pendant la nuit et le tissu a été homogénéisé. L&#39;homogénat a été incubé avec Cam-sépharose billes en présence soit de Ca 2 + ou de l&#39;EDTA. Entrée homogénat montre que la GFP-Ng a été exprimé, en plus de endogènes Ng et Ca 2 + / CaM-kinase dépendante II(CaMKII). Comme attendu basé sur la liaison connue de Ng endogènes (illustré dans la Fig. 2A), la GFP-tagged Ng a été élue en l&#39;absence de Ca 2 + (EDTA lié aux protéines) et non lié à la présence de Ca 2 + (figure 2B) . En revanche, le contrôle, CaMKII, a été élue uniquement en présence de Ca 2 + (protéines) et a été détaché dans son absence (EDTA). Cela montre que les perles étaient CaM fonctionne correctement et le élutions ont été efficaces. Plus important encore, cela montre que la GFP-Ng se lie à ApoCaM d&#39;une façon similaire à la forme endogène, ce qui suggère que la balise GFP ne modifie pas la fonction de notre protéine recombinante. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Schéma de la CAM pull-down assay (A) homogénat tissulaire est centrifugé pour enlever les débris cellulaires. Environ 10% du surnageant est pris comme un échantillon de l&#39;entrée (1). Le surnageant restant est divisé de manière égale pour les différentsconditions et les réactifs appropriés (CaCl 2 ou EDTA) sont ajoutés au test de liaison dans ces conditions. Chaque surnageant (contenant soit CaCl 2 ou EDTA) est chargé sur le prêt, respectivement CaM-sépharose perles et (B) incubée pour permettre la liaison. Les protéines non liées sont éliminées (2) et (C) les protéines liées (3) sont élués hors des perles à l&#39;aide du tampon d&#39;élution (EB) contenant la condition opposée comme la liaison. La composition protéique de ces trois échantillons de protéines peuvent être analysées par SDS-PAGE et Western blot. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. A.) Schéma de Ca 2 +-dépendante contraignante Cam et élution dans les exemples de dosage déroulant sont donnés des deux types de protéines qui se lient dans une CaM Ca 2 +-dépendante. Neurogranine (Ng) représente protéines qui se lient apo-Cam et CaMKII représente les protéines qui se lient à Ca 2 + richesCaM. Cam est représenté dans son état dissocié avant incubation avec les protéines d&#39;homogénat. Une fois mis en incubation dans des conditions de haute concentration de Ca 2 + (2 mM) ou en présence d&#39;un chélateur de Ca 2 +, l&#39;EDTA (2 mM), les protéines se lient à la CaM conséquence. Ng lie CaM dans l&#39;état de l&#39;EDTA comme il ya peu ou pas de Ca 2 + présent, et serait élué hors les perles CaM-sépharose, en présence de Ca 2 +. CaMKII, cependant, se lierait à Cam, en présence de quantités élevées de Ca 2 + et serait dissocier une fois que le Ca 2 + a été chélaté. B.) Les résultats de la CaM exemple déroulant dosage. Ce chiffre démontre le résultat final attendu d&#39;une came-sépharose tirer vers le bas avec les échantillons sondé pour Ng et CaMKII. Tant l&#39;Ng endogènes et GFP-Ng sont présents dans les ruelles de protéines liées à la CAM en présence d&#39;EDTA. Pas Ng est lié lorsque les échantillons sont incubés avec Cam, en présence de Ca 2 +, ce qui démontre que Ng ne lie que l&#39;apo-CAM. Notre contrôle positif, CaMKII, d&#39;autre part, se lie à la CaM seulement en présence de Ca 2 +.

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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Le protocole fourni utilise CaM-sépharose perles pour enquêter sur le Ca 2 +-dépendance de la CaM des protéines de liaison. De nombreuses protéines se lient dans une CaM Ca 2 +-dépendante. Ces interactions sont d&#39;une grande importance étant donné le nombre de CaM des protéines de liaison et leur rôle crucial dans de nombreuses voies de signalisation. Dans ce protocole, Cam-sépharose perles sont utilisées pour séparer des protéines de liaison de la CaM d&#39;homogénat de tissu en ...

<table border="1"><tr><td> Produit </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Remarques </td></tr><tr><td> La calmoduline-sépharose perles </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CaMKII alpha </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranine </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Conseils Gel Loading Pipet </td><td> Fisher </td><td> 02-707-138 </td><td> Utilisez pour l&#39;aspiration de surnageants </td></tr><tr><td> Tubes de centrifugation (2,0 ml) </td><td> Fisher </td><td> 05-408-146 </td><td> Utiliser pour toutes les étapes impliquant la calmoduline-sépharose perles </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

Le calcium (Ca 2 +) est un ion essentiel dans la régulation de la fonction cellulaire à travers une variété de mécanismes. Beaucoup de Ca 2 + de signalisation est médiée par la protéine liant le calcium connu comme la calmoduline (CaM) 1,2. Cam est impliqué à plusieurs niveaux dans presque tous les processus cellulaires, y compris l&#39;apoptose, le métabolisme, la contraction des muscles lisses, la plasticité synaptique, la croissance des nerfs, l&#39;inflammation et la réponse immunitaire. Un certain nombre de protéines aident à réguler ces voies grâce à leur interaction avec la CaM. Beaucoup de ces interactions dépendent de la conformation de came, qui est nettement différente lorsqu&#39;il est lié à Ca 2 + (Ca 2 +-CaM) par opposition à sa Ca 2 + sans état ​​(ApoCaM) 3. Alors que la plupart des protéines cibles se lient Ca 2 +-CaM, certaines protéines ne se lient à ApoCaM. Certains CaM lient par leur QI-domaine, y compris neuromodulin 4, neurogranine (Ng) 5, et certaines myosines <sup&gt; 6. Ces protéines ont été montré à jouer un rôle important dans la fonction présynaptique 7, fonction postsynaptique 8 et 9 contraction des muscles, respectivement. Leur capacité à se lier et libérer Cam en l&#39;absence ou la présence de Ca 2 + est le pivot de leur fonction. En revanche, de nombreuses protéines ne se lient Ca 2 +-CaM et nécessitent cette liaison pour leur activation. Les exemples incluent la myosine kinase à chaîne légère 10, Ca 2 + / CaM-kinases dépendantes (CaMKs) 11 et les phosphatases (par exemple la calcineurine) 12, et la spectrine kinase 13, qui ont une variété d&#39;effets directs et aval 14. Les effets de ces protéines sur la fonction cellulaire sont souvent dépendants de leur capacité à se lier à Cam dans un Ca 2 +-dépendante. Par exemple, nous avons testé la pertinence de Ng-CAM obligatoire dans la fonction synaptique et la façon dont les mutations affectent différentes cette liaison. Nous avons généré une con-GFP taggés Ngstruct avec des mutations spécifiques dans le IQ-domaine qui allait changer la capacité de se lier Ng CAM dans une Ca 2 +-dépendante. L&#39;étude de ces différentes mutations nous a donné une grande perspicacité dans les processus importants impliqués dans la fonction synaptique 8,15. Cependant, dans de telles études, il est essentiel de démontrer que les protéines mutées ont altéré la liaison prévue à Cam. Ici, nous présentons une méthode pour tester la capacité des protéines à se lier à Cam en présence ou en absence de Ca 2 +, en utilisant CaMKII et Ng comme exemples. Cette méthode est une forme de chromatographie d&#39;affinité appelé CaM déroulant dosage. Il utilise la CaM-Sépharose perles de tester les protéines qui se lient à came et l&#39;influence de Ca 2 + sur cette liaison. Il est temps considérablement plus efficace et nécessite moins de protéine par rapport à la chromatographie colonne et d&#39;autres épreuves. Au total, cela donne un outil précieux pour explorer Ca 2 + de signalisation Cam / et de protéines que dansteract avec Cam.

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Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calmoduline (CaM) pull-down test est un moyen efficace pour étudier l&#39;interaction de la CAM avec diverses protéines. Cette méthode utilise la CaM-sépharose perles pour une analyse efficace et spécifique des protéines liant la CaM. Cela fournit un outil important d&#39;explorer de signalisation CAM dans la fonction cellulaire.

Pull-down des protéines se liant à la calmoduline

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Research

JoVE Journal

Biology

25.3K vues.  Medical College of Wisconsin. Calmoduline (CaM) pull-down test est un moyen efficace pour étudier l'interaction de la CAM avec diverses protéines. Cette méthode utilise la CaM-sépharose perles pour une analyse efficace et spécifique des protéines liant la CaM. Cela fournit un outil important d'explorer de signalisation CAM dans la fonction cellulaire.

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Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Séparation électrophorétique de protéines

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Recherche

Biologie

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Coloration protéines dans les gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Impression par microcontact de protéines pour la biologie cellulaire

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

À haut débit Affinity Purification de protéines recombinantes-étiquette

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Vivez l&#39;imagerie des protéines GFP-étiquetés<em&gt; Drosophila</em&gt; Les ovocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Expression transitoire de protéines par hydrodynamique Gene livraison chez la souris

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immunodétection de la membrane externe de protéines par cytométrie en flux de mitochondries isolées

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).