Nous remercions Kristin Johnson pour le travail graphique.

Tous les protocoles impliquant des animaux sont présentés et approuvés par le Comité de protection des animaux dans les institutions et l&#39;utilisation de l&#39;Hôpital pour enfants de Boston et sont menées en conformité avec les recommandations de l&#39;Association pour l&#39;évaluation et l&#39;accréditation des laboratoires de protection des animaux (AAALAC). Veillez à utiliser des instruments stériles et techniqure aseptique lors de l&#39;exécution de la procédure. 1 Préparation de Pellets <ol><li> Peser 10 mg de sucralfate et 60 mg de hydron avec la spatule déplié stérile. Placez-les dans des microtubes séparés. </li><li> Placez un carré de 1 cm de maille dans une boîte de 10 cm stérile. Inverser si maillage repose sur le couvercle peu profond. Mettez de côté. </li><li> Ajouter 500 pi d&#39;éthanol à la hydron et vortex pendant au moins 10 min. </li><li> Ajouter la quantité appropriée du facteur de croissance (standard: 20 pg de bFGF, 50 pg de VEGF) au sucralfate et vortex brièvement. facteur de croissance de magasin dans unCongélateur -80 ° C à une concentration de 1 mg / ml. Volumes ajoutés liquides doivent avoir un minimum de 20 pi pour assurer le sucralfate est complètement imbibé, mais ne doivent pas dépasser 50 pi. Plus grand volume rend l&#39;évaporation du liquide dans l&#39;étape suivante difficile. </li><li> Placer le mélange de sucralfate dans l&#39;évaporateur centrifuge attachée bas jusqu&#39;à ce que le mélange soit complètement sec, normalement 30-50 min en fonction du volume de liquide utilisé. <ol><li> Vérifier le mélange de l&#39;humidité résiduelle avec l&#39;extrémité conique d&#39;une spatule stérile. Le mélange doit se sentir &quot;croquant&quot;. </li></ol></li><li> Utiliser l&#39;extrémité effilée de la spatule pour disperser le mélange de sucralfate dans le tube. </li><li> Ajouter 10 ul de la hydron au sucralfate. <ol><li> En raison de la nature visqueuse de hydron, couper l&#39;extrémité d&#39;une pointe de pipette 200 pi, puis tirer et libérer les 10 pi avant pipetage à nouveau et ajouter à sucralfate. </li></ol></li><li> Utiliser rapidement naissain pliéula de mélanger la hydron et sucralfate et de retirer de tube. <ol><li> Recueillir le mélange le long du côté inférieur de la pointe de la spatule et ensuite pliée faire tourner le tube en tirant sur la spatule le long de la paroi du tube. Le mélange va sécher rapidement si cette étape doit être fait efficacement. </li></ol></li><li> Étendre le mélange sur le maillage préparé en utilisant une pince pour le maintenir en place. Le mélange doit être une couche régulière et introduire dans les trous de la maille. </li><li> Plonger la spatule coudée dans le tube contenant hydron et utiliser l&#39;enrober de la maille. </li><li> Placez la maille enduit se penchant sur le côté contre le bord du plat et laisser sécher à température ambiante pendant 30-45 min. </li><li> Placer la grille dans -20 ° C congélateur ou procéder immédiatement à l&#39;étape suivante. Gardez maillage à l&#39;intérieur plat. </li><li> Placez la boîte de 35 mm à l&#39;intérieur de la boîte de Pétri plus grande, couvercle. Utilisez la pince pour tirer délicatement les fibres du maillage à part sur la boîte de 35 mm. Granulés errants cun être collectées à partir de la plus grande plat à la fin. <ol><li> Vérifiez pastilles d&#39;uniformité dans la portée. Le procédé permet d&#39;obtenir environ 250 pastilles ainsi la dose standard par pastille pour bFGF et VEGF est de 80 ng et 200 ng, respectivement. </li></ol></li><li> Rangez les granules en boîte de 35 mm à -20 ° C congélateur jusqu&#39;à 3 mois. </li></ol> 2. implantation chirurgicale de Pellets <ol><li> Mettre en place une zone chirurgicale sous microscope opératoire. </li><li> Anesthésier la souris avec Avertin (400-500 mg / kg, par voie intrapéritonéale) et placez la souris au microscope afin œil est visible. Effectuer pincement de l&#39;orteil pour assurer un niveau suffisant de l&#39;anesthésie. </li><li> Anesthésier l&#39;oeil de la souris en plaçant une goutte de solution de proparacaïne sommet globe oculaire. Attendez 20-30 secondes et tamponner avec un tampon de gaze. </li><li> Proptose l&#39;œil de la souris avec le # 1 émoussé bijoutiers forceps étant certain de laisser la peau entre les pinces et les yeux. Il est important d&#39;évaluer la pression appliquée correctement.60; Tenir l&#39;œil trop fermement va l&#39;amener à devenir rouge et irritée, mais trop de laxisme attente permettra œil de se déplacer pendant la chirurgie. </li><li> Utilisez le 30 ° microknife de faire une incision dans la cornée environ 1 mm du limbe. L&#39;incision doit être de 1 à 2 mm de longueur. L&#39;incision doit être suffisamment profond pour pénétrer au-delà de la couche épithéliale dans midstroma mais pas si profonde à la rupture de l&#39;oeil. </li><li> Utilisez le couteau von Graef à faire une poche perpendiculaire à l&#39;incision. <ol><li> Faites glisser le couteau sous la couche cornée au site d&#39;incision et de travailler en douceur couteau et de se déplacer le long de l&#39;incision pour agrandir l&#39;espace, formant ainsi la poche. Il permet de déplacer la souris ainsi être en mesure de travailler avec la courbure de l&#39;œil. Attention à ne pas pousser vers le bas avec la pointe pour éviter une rupture de l&#39;œil. </li></ol></li><li> Mouiller les pinces de la n ° 5 bijoutier avec proparacaïne et prendre une pastille sortir du plat. Placez une pastille sur l&#39;œil. </li&gt; <li> Humidifiez le couteau von Graef avec proparacaïne et transférer une partie de liquide sur culot de le faire caoutchouteuse et souple. Retirer l&#39;excès d&#39;humidité avec un tampon de gaze ou un coton-tige. </li><li> Insérez le culot dans la poche à l&#39;aide du couteau von Graef à pousser à l&#39;intérieur au-dessous de la couche cornée. Une fois que tout le culot est à l&#39;intérieur, exécutez le côté plat du couteau von Graef sur site pour vérifier que la pastille est sécurisé. </li><li> Manteau de l&#39;œil avec de l&#39;huile triple antibiotique. </li><li> Retournez la souris et répétez la chirurgie de l&#39;œil opposé. </li></ol> 3 Quantification de néovascularisation cornéenne. Laissez les animaux de développer les navires sur une période de temps définie. Le jour de navire classement dépend de facteurs de croissance utilisé. Année bFGF au jour 5 et le VEGF faible à J6 Le jour de l&#39;implantation est le jour 0. <ol><li> Anesthésier la souris avec Avertin (400-500 mg / kg, par voie intrapéritonéale). </li><li> Utilisation du microscope à lampe à fente pour grading. On a un réticule oculaire, des lignes à l&#39;intérieur de l&#39;oculaire utilisé comme auxiliaire de mesure pour quantifier la longueur du bateau et de la distance autour de la circonférence de l&#39;oeil que les récipients ont germé. <ol><li> Maintenez la souris en face de portée, en positionnant la souris afin œil est vu dans oculaire avec culot directement en avant. Stabiliser la tête entre le pouce et l&#39;index pour une peau est serré sur le visage et les yeux légèrement proptosed. </li></ol></li><li> Placer l&#39;axe des y du réticule le long du navire juste au-dessous du limbe pastille. Mesurer la longueur des navires de branchement vers le haut vers pastilles. Noter cette mesure en dixièmes de millimètres et désigner la longueur de la cuve (VL) (Figure 1A). </li><li> Mettez la souris ou le réticule de sorte que la distance autour de l&#39;œil que ces navires ont germé devient clair. Il est plus facile de penser à l&#39;œil comme une horloge avec des intervalles de 1 à 12 Désigner ce numéro heure d&#39;horloge (CH) (Figure 1B). Il peut s&#39;agir d&#39;un nombre ou de fractions de 0,25 (par exemple, 2, 2,25, 2,5 ou 2,75) ensemble. Remarque: CH est subjective. Par exemple, certains peuvent mesurer la distance autour de l&#39;œil à tous les navires germées à partir du limbe tandis que d&#39;autres peuvent arrêter la mesure à l&#39;endroit où la longueur du navire est la moitié maximale. Le facteur important est d&#39;être cohérent avec la façon dont on choisit de qualité. </li></ol><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1.jpg" /> Figure 1: Quantification de la néovascularisation de la cornée. (A) 80 ng bFGF culot implanté dans C57BL / 6J montrant la lampe à fente réticule orienté pour mesurer la longueur du navire. VL = 0,9 mm. (B) Même démontrant des yeux lampe à fente réticule rotation pour mesurer heure d&#39;horloge. CH = 3,25. Calculé zone de la cuve = 1,84 mm 2. Ces images ont été digitalement augmentée pour permettre l&#39;ajout de schématique réticule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <ol start="5"><li> Calculez la surface de la cuve (VA) en utilisant la formule ci-dessous, qui est basé sur la zone d&#39;un ovale (Note, il est utile de garder cela à l&#39;esprit lors de la notation.) Express VA en millimètres carrés. La formule est la suivante: Navire de longueur x Horloge heure x 0,2 π = zone de navire </li></ol>

<ol>
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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+response+of+FGF-2+for+lymphangiogenesis.">Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).</li><li>Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+suppression+of+angiogenesis+following+radiation+exposure+is+independent+of+hematopoietic+reconstitution.">Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution.</a> Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).</li><li>Turner, P. V., Albassam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+rats+to+corneal+lesions+after+injectable+anesthesia.">Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia.</a> Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).</li><li>Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+reversible+cataract+induced+by+xylazine+and+by+ketamine-xylazine+anesthesia+in+rats+and+mice.">Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice.</a> Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

Il ya plusieurs étapes critiques dans la réalisation d&#39;une analyse de la cornée réussie. La première consiste à créer des pastilles uniformes susceptibles d&#39;être implanté et en stimulant les vaisseaux. Les parties les plus importantes de la préparation de granulés sont 1) en utilisant le facteur de croissance sans support; 2) assurer un bon mélange de facteur de croissance avec le sucralfate et hydron et 3) le déplacement du mélange final rapidement mais avec précaution du tube Eppendorf à la mai...

Le processus de l&#39;angiogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins se forment des préexistants, est très complexe et est régulée par plusieurs facteurs endogènes qui contrôlent les différentes étapes de la germination et de la morphogenèse de la cuve. L&#39;angiogenèse est déclenchée en raison d&#39;un changement dans l&#39;équilibre entre les facteurs pro et anti-angiogéniques, un équilibre qui maintient normalement le système vasculaire dans un état de repos. L&#39;angiogenèse se produit chez l&#39;adulte dans certaines conditions physiologiques, tels que au cours du cycle ovarien femelle ou dans les processus de réparation tels que la cicatrisation des plaies et la régénération des tissus. Cependant, il est également une caractéristique de nombreuses pathologies, notamment les tumeurs malignes, les conditions auto-immunes et des maladies inflammatoires. L&#39;implication de l&#39;angiogenèse dans les conditions physiologiques et pathologiques, il est un important sujet de recherche et une cible intéressante pour une thérapie. En raison de la complexité de l&#39;angiogenèse et de l&#39;implication de plusieurs CElls et les facteurs dans le processus, y compris les cellules endothéliales, les péricytes, cellules circulantes et les cellules stromales, des modèles in vitro restent limitées et ne peuvent pas récapituler le microenvironnement in vivo unique. Le principal des essais in vitro de l&#39;angiogenèse sont en grande partie axées sur l&#39;observation des effets directs sur les cellules endothéliales et de mesurer certaines étapes du processus angiogénique dans des conditions contrôlées. Ces analyses comprennent la quantification des cellules endothéliales prolifération une migration 2, la formation du réseau 3, formation du tube 4 et la germination de sphéroïdes 5. Modèles ex vivo, contrairement à celles in vitro, sont plus complexes et intégrer de multiples types de cellules des tissus, un exemple étant le test de l&#39;anneau aortique 6. Néanmoins, comme d&#39;autres systèmes, on ne peut pas capturer la contribution de cellules circulantes du stroma et des cellules endothéliales naturel que celui qui existe in vivo. Tentativespour étudier l&#39;angiogenèse sous flux d&#39;imiter la mise en vivo sont réalisés en utilisant des systèmes microfluidiques 7, mais même ces tests, bien que beaucoup sont améliorées, sont encore incapables de rendre compte de tous les compartiments existants in vivo. En raison des limitations de l&#39;in vitro et ex vivo de l&#39;angiogenèse des modèles, des modèles in vivo restent les plus fiables de choix pour l&#39;étude de l&#39;angiogenèse. Des exemples de ces modèles comprennent l&#39;implantation des chambres transparentes, des «fenêtres», qui permettent la visualisation des vaisseaux sanguins en croissance sous microscope 8, implants sous-cutanés injectables tels que matrigel et récipient formation dans les tissus normaux tels que l&#39;oreille de la souris et la membrane chorio-allantoïde de poulet (CAM ). Cependant, l&#39;un des modèles les plus acceptables et quantitatives in vivo l&#39;angiogenèse est l&#39;essai de micropoche de néovascularisation de la cornée est décrit ici, qui exploite le naturellement avasculairecornée comme un «écran» de visualiser et d&#39;évaluer une nouvelle croissance angiogénique 9. Nous décrivons ici le test de micropoche cornéen développé chez la souris. Initialement, le modèle a été utilisé pour mesurer des stimuli angiogéniques non spécifiques dans les cornées de lapin. Cela a été fait par introduction des morceaux de tumeur dans l&#39;humeur aqueuse de la chambre antérieure de l&#39;œil de lapin et de mesurer la néovascularisation induite par une tumeur 11. Cependant, l&#39;essai a été plus tard évolué pour étudier les effets de croissance spécifique des facteurs 10 de mieux préciser et normaliser l&#39;effet angiogénique. Afin de libérer le facteur de croissance de l&#39;œil, des granulés à libération lente contenant des quantités connues de facteurs de croissance angiogéniques ont été utilisés à la place des tissus. La disponibilité de protéines angiogéniques recombinants purifiés tels que bFGF ou VEGF a permis leur utilisation comme objectifs spécifiques de modulaters de l&#39;angiogenèse 12. Dans un premier temps, le dosage étaitlargement utilisé chez les lapins, qui sont plus faciles à travailler en raison de leur taille, mais plus tard, le modèle a été traduit dans des souris; un modèle animal plus petit et moins coûteux. Le passage de lapin à la souris fournit un avantage important d&#39;être en mesure d&#39;utiliser des animaux génétiquement modifiés, créant ainsi un nouveau domaine de recherche sur les composantes génétiques qui influent angiogenèse 13. En plus de l&#39;utilisation plus acceptable de dosage de cornée dans l&#39;étude de l&#39;angiogenèse, d&#39;autres processus biologiques peuvent également être étudiées en utilisant des tests modifiés. Par exemple, des études de la lymphangiogenèse ont été rendues possibles grâce à l&#39;implantation de pastilles à faible dose bFGF qui a permis la visualisation des vaisseaux lymphatiques par marqueurs moléculaires spécifiques 14. En outre, cet essai a fourni un moyen pour évaluer les effets du rayonnement sur ​​l&#39;angiogenèse 15. En résumé, l&#39;analyse de l&#39;angiogenèse de la cornée micropoche est une quantitative, représentantroducible, évaluation souple de l&#39;angiogenèse in vivo. Un avantage majeur de cette analyse est que le jaugeage des bateaux de fond n&#39;est pas nécessaire parce que les vaisseaux se développent sur un tissu naturellement avasculaire. Nous décrivons ici le protocole de cet essai dans les détails et discuter de différents scénarios qui peuvent se produire. Le test se compose de 3 segments distincts. Ici, nous allons décrire la préparation de pastilles de facteur compris la croissance, l&#39;implantation chirurgicale ultérieure, et finalement la méthode utilisée pour quantifier la croissance néovasculaire résultant.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Section 1: Pellet preparation</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucralfate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#S0652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydron (aka Poly(2-Hema))</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#P3932-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:111px;">Pharmco Products Inc</td>
			<td style="width:119px;">#111000200CSGL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Growth factors:</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;Fibroblast growth factor (FGF)</td>
			<td style="width:111px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vascular endothelial growth factor (VEGF)</td>
			<td style="width:111px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">#293-VE-050/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm dish</td>
			<td style="width:111px;">Becton-Dickson</td>
			<td style="width:119px;">#353001</td>
			<td>Used for storage of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">#25384-342</td>
			<td>Used as work surface for preparing pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mesh</td>
			<td style="width:111px;">Sefar America</td>
			<td style="width:119px;">#03--300/51</td>
			<td>300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spatulas</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21-401-10</td>
			<td>Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#05-408-146</td>
			<td>One for hydron, one for sucralfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2315E</td>
			<td>Need 2 for pulling mesh apart</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal evaporator</td>
			<td style="width:111px;">ThermoSavant</td>
			<td style="width:119px;">DNA110 SpeedVac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 2: Surgical implantation of pellets</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Operating microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5%</td>
			<td style="width:111px;">Falcon</td>
			<td>NDC# 6131401601</td>
			<td>Eye anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:111px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:119px;">NDC# 2420878055</td>
			<td>Contains neomycin, polymixin and bacitracin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ophthalmic microknife, 5 mm</td>
			<td style="width:111px;">Surgistar</td>
			<td style="width:119px;">#924501</td>
			<td>30 degree angle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">von Graef knife</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#3401E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #1</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2301E</td>
			<td>Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2305E</td>
			<td>For picking up pellets and placing on eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small curved scissors</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#5636E</td>
			<td>For trimming whiskers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For blotting eye after proparacaine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 3: Grading of Corneal Neovascularization</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Slit lamp</td>
			<td style="width:111px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">FS-2</td>
			<td>Needs an ocular with a reticule to assist in measuring</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the corneal micropocket assay: a model of angiogenesis in the mouse eye

L&#39;essai de micropoche de la cornée de la souris est un test robuste et quantitative in vivo pour l&#39;évaluation de l&#39;angiogenèse. En utilisant des pastilles standardisés à libération lente contenant des facteurs de croissance spécifiques qui déclenchent la croissance des vaisseaux sanguins tout au long de la cornée naturelle avasculaire, l&#39;angiogenèse peut être mesurée et quantifiée. Dans cet essai, la réponse angiogénique est généré au cours de plusieurs jours, selon le type et la dose de facteurs de croissance utilisé. L&#39;induction de la néovascularisation est généralement déclenchée soit par le facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) ou un facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF). La combinaison de ces facteurs de croissance avec le sucralfate et hydron (poly-HEMA (poly (méthacrylate de 2-hydroxyéthyle))) et couler le mélange en pastilles, ils peuvent être implantés chirurgicalement dans l&#39;oeil de la souris. Ces pastilles uniformes libèrent lentement les facteurs de croissance au cours de cinq ou six jours (bFGF ou VEGF respectivement) permettant réponse angiogénique suffisant requis pour la zone de la cuve qUANTIFICATION en utilisant une lampe à fente. Ce dosage peut être utilisé pour différentes applications, y compris l&#39;évaluation de médicaments modulateurs angiogéniques ou des traitements, ainsi que la comparaison entre les différents fonds génétiques qui affectent l&#39;angiogénèse. Un enquêteur qualifié après avoir pratiqué ce test peut implanter une pastille en moins de 5 minutes par œil.

Des résultats typiques pour le bFGF et VEGF pastilles dans les basses angiogéniques C57BL / 6J normaux sont présentés dans la figure 2A et B, respectivement. Figure 2E montre la distribution normale de la surface de la cuve (VA) dans la / souche 6J C57BL avec des doses variables de ceux-ci la croissance facteurs. 80 pastilles de bFGF ng entraînent normalement dans un VA d&#39;environ 2,0 mm 2, si les valeurs dans une plage de 1,8-2,4 mm 2 sont...

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The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Le protocole décrit l&#39;essai de micropoche de la cornée tel que développé chez la souris.

La cornée micropoche test: Un modèle de l&#39;angiogenèse dans l&#39;oeil de la souris

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K vues.  Boston Children's Hospital.  Le protocole décrit l'essai de micropoche de la cornée tel que développé chez la souris. 

Vidéo: The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

L&#39;isolement et expansion des cellules souches neurales de souris adultes utilisant le test Neurosphère

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

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Neurosciences

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Établir embryonnaires de la souris culture de cellules souches neurales utilisant le test Neurosphère

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissection d&#39;un oeil de la souris pour un mont entiers de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Un modèle Optic Nerve Crush blessures murins pour étudier la rétine de survie des cellules ganglionnaires

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer&#039;s Disease Mouse Model

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

La détection de plaques séniles dans le modèle d&#39;Alzheimer La maladie de la souris

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Mont entiers immunofluorescence de la rétine de souris néonatal chargé d&#39;enquêter sur l&#39;angiogenèse<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolement et culture de cellules endothéliales de la embryonnaire du cerveau antérieur

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

Un test comportemental simple pour tester la fonction visuelle dans<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

Activité de la télomérase dans les différentes régions du cerveau de souris: la télomérase non-radioactifs Répétition protocole d&#39;amplification (TRAP) Dosage

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

Une méthode volumétrique pour la Quantification du vasospasme cérébral dans un modèle murin d’hémorragie sous-arachnoïdienne

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...