The authors do not have any acknowledgements.

כל ההליכים המתוארים חייבים להתבצע בהתאם להנחיות והתקנות לשימוש בבעלי חיים בעלי חוליות, כוללים אישור מראש על ידי הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש המקומית. 1. הכנת מכשירי הביתור ותרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביסה מוקדמת כל המכשירים לשימוש בנתיחה עם מי חמצן 3% ולאחר מכן החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. סנן תקשורת BGJb עם פתרון אנטיביוטי וantimycotic באמצעות מסנן נקבובית בגודל 0.22 מיקרומטר עם שאיבת ואקום במנדף. </li></ol> 2. הכנת תרבות הציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך מסנני קרום פוליקרבונט שיתמכו באיברי החיך במשולשים קטנים, לרסס עם אלכוהול 70% ולאפשר להם להתייבש. הכן צלחת המרכז-ובכן האיברים תרבות (60x15 מ&quot;מ) על ידי הצבת רשת נקייה ומעוקרת שווה צלעות בצורת משולשת תיל (20 מ&quot;מ) על צלחת תרבות איבר. ואז למלא היטב עם 1 מיליליטר של Bתרבות תקשורת תקשורת GJb. הערה: התקשורת צריכה להיות מספיק כדי להגיע לרמה של הרשת ללא הצללה החיך. מניחים את מסנני קרום, הצד מבריק כלפי מטה, על גבי הרשת (3-4 ממברנות לרשת) .Depending בניסוי, ניתן להוסיף טיפול (חלבונים, נוגדנים או מעכבים) לתקשורת </li></ol> 3. העובר עכבר איסוף והכנה לתרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג עוברי עכבר סוג בר, שימוש בעיתוי 13.5 מתח רקע גנטי בהריון CD-1 עכבר. נקה את האזור לנתיחה עם אתנול 70%. הערה: זנים אחרים של עכברים יכולים לשמש. אנחנו מעדיפים CD-1 עכברים בגלל מספר ההמלטה הגדולה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בהריון בE13.5 DPC (ימים שלאחר משגל) עם 5% Isoflurane אחריו נקע בצוואר רחם כדי להבטיח מוות באמצעות פרוטוקולים שאושרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריסוס אתנול 70% על פני בטן הגחון כדי להימנע מצורך שיער מקל הבטן למכשירים. לאחר מכן פתח את חלל בטן ventrallyבאמצעות מספריים חדים-הפעלה בוטה ומלקחי מיקרו לנתח כדי לאתר את הרחם. שימוש במלקחיים, להרים את כל הרחם ולהפריד אותו מהגוף על ידי חיתוך בגוף הרחם ובטיפים של קרן הרחם עם מספריים הפעלה אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרחם על מגבת נייר נקייה על קרח (לדברי מדריך הפרוטוקול לטיפול ושימוש בבעלי החיים במעבדה). מכסה את הרחם עם מגבת נייר נקייה אחרת על מנת למנוע זיהום. לעקר את המכשירים באמצעות 70% אתנול תרסיס לפני שימוש נוסף. הרחם והעוברים יכולים להיות מועברים למעבדה על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזרימה למינרית פתוחה, להפוך בזהירות פתח קטן בצק החלמון באמצעות מספריים חדים-הפעלה בוטה ומלקחי מיקרו לנתח. הפוך את הפתיחה רחבה יותר ולאחר מכן בעדינות לדחוף אותו לexteriorize את העובר מן שק החלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העוברים מייד לצלחת פטרי עם pH הקר פוספט שנאגרו מלוח 1X (PBS) 7.4. כדי להבטיח את השלב, לשעבר הנכוןאמין העובר תחת מיקרוסקופ לנתח למורפולוגיה גוף, גודל הראש והגפיים. הערה: עוברים שאינם בשלב הנכון של פיתוח אינם משמש לניסוי. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig2.jpg" /> איור 2. איבר באד מורפולוגיה. קדמת הבמה והגפיים אחוריות נבדקות לתואר של כניסה חגורה בין הספרות. בE13.5, כל condensations הספרות בולט, עם חגורה וחריצי דיסטלי בין ספרות המופיעים מאוד ברורים. הספרות האחורית היא מאחורי בחצי יום 12 שורה עליונה:. Forelimb, שורה תחתונה: גפיים אחוריות. 4. חך Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עובר אחד בכל פעם בצלחת פטרי עם PBS תחת מיקרוסקופ לנתח. מספריים שימוש קטנים לנתח ופינצטה להפריד את הראש מהגוף של העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק בזהירות את גולגולת העכבר מעל גובה עיניים עם מלקחיים (הימנעותתהליך הלסת) לעשות שני חתכים בשני הצדדים של קו השפתיים. ואז להסיר את הלסת התחתונה ולשון. לבודד את אזור לסת תהליך על ידי ביצוע חתך בגובה עיניים ולהסיר את המוח, עיניים, מחיצת האף ורקמות הסמוכות. </li></ol><img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig3.jpg" /> רקמת 3. חך איור נאספה מ13.5 עוברים, כאשר מדפי החך שהעלו, אך לא יצרה קשר. מדפי החך הונחו בתרבות איבר במסנן בממשק תקשורת האוויר במשך 72 שעות במודל הסטטי. (א) רמה של כוכבי נתיחה על עובר E13.5. (ב) הכחולה לתחום אזורים להחזיק את הרקמה עם מלקחיים במהלך נתיחה. צפה (C) של מדפי חך גזור מונחים על קרום מסנן טרפז. מבט צד (D) של צלחת התרבות אחרי המיקום של חיך גזור ותוספת של תקשורת ותרבות. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את צד הפה החיך ולהסיר את מחיצת האף ורקמות סביבו, שמירה על החיך העיקרי המצורף כדי לסייע לה להתמצא מקדמי לאחורית. השתמש במרית כף ולהעביר בזהירות רבה את מדפי החך (צד האף למטה) למסננים מוכנים ברשתות במנות התרבות. הערה: התאם את עוצמת קול של מדיה כדי לאפשר ממשק אוויר תקשורת נכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למיקרוסקופ סטריאו, לנתח את החיך הראשוני ולהשתמש בפינצטה כדי למקם את מדפי החך קרובים אחד לשני. מדפי החך לא הפתיל אם הם לא ממוקמים במגע. חותך את מסנן הקרום המשולש שבו החלק הקדמי של החך ממוקם. צורת הטרפז תסייע באיתור החלק הקדמי של החך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות מדפי חך בנפרד או עם שתיים או שלושה באותו צלחת תרבות איבר באמצעות תקשורת ותרבות BGJb. </li></ol> 5. מדפי Culturing עכבר Palatal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה tissues על 37 מעלות צלזיוס בתערובת humidified גז (5% אוויר CO 2 ו -95%) במשך 72 שעות, ולשנות את המדיום כל שעה 24. </li></ol> 6. חך עיבוד לניתוח היסטולוגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן את החיך לאחר 72 שעות בתרבות עם 4% פורמלדהיד / O פוספט שנאגרו מלוח / N ב 4 ° &#160; ג ואז, בעדינות עם טפטפת העברה לשטוף את הרקמה בצלחת התרבות עם PBS. לעטוף את החך בפיסת מגבוני מעבדה ומקום בהטבעת קלטות. הערה: גלישת החיך במגבוני מעבדה למנוע האובדן שלהם במהלך תהליך ההתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את הרקמה הבאה 70%, 80% ועד 100% אתנול שוטף עבור שעה 1, ואחריו את הליך הטבעת פרפין הרגיל. להטבעה, תניח את החלק הקדמי של החך מול המגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך 6 מיקרומטר סעיפים סידוריים בכיוון העטרה מקדמי לאחוריים. חיך סעיף שלם יניב 350-450 sectiהרחבות. להכתים את החלקים עם hematoxylin ו eosin (H &amp; E). בקנה מידה 10 כל סעיף 20 ה באמצעות ציון ממוצע היתוך שתואר לעיל (MFS) (טבלת 1). 8 </li></ol>

<ol>
	<li>Nawshad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+seam+disintegration+to+die+or+not+to+die+that+is+no+longer+the+question.">Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).</li><li>Strong, E. B., Buckmiller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+the+cleft+palate.">Management of the cleft palate.</a> Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).</li><li>Witt, P. D., Marsh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+assessing+outcome+of+surgical+repair+of+cleft+lip+and+cleft+palate.">Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate.</a> Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).</li><li>4miloro, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).</li><li>Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+epithelial+adhesion+molecule+CEACAM1+is+important+for+palate+formation.">Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation.</a> PloS one. 8, e61653 (2013).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro+an+analysis+by+DiI+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy.</a> Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).</li><li>Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+cultured+palatal+shelves+from+alligator+chick+and+mouse+embryos.">Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos.</a> The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).</li><li>San Miguel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin+reverse+signaling+controls+palate+fusion+via+a+PI3+kinase+dependent+mechanism.">Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).</li><li>Kang, P., Svoboda, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI+3+kinase+activity+is+required+for+epithelial+mesenchymal+transformation+during+palate+fusion.">PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).</li><li>RD, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Taher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+of+murine+limb+development.">Global gene expression analysis of murine limb development.</a> PloS one. 6, e28358 (2011).</li></ol>

The authors do not have any competing financial interests.

הפרוטוקול במאמר זה מספק שיטה של ​​לנתח מדפי חך מעוברים ביום עוברי 13.5. מדפי חך מעוברי עכברים היו בתרבית בתקשורת ותרבות סרום ללא באווירה של 95% O CO 2 5% 2 על 37 מעלות צלזיוס. נתיחת חיך מוצלחת תלויה באופן קריטי על גורמים רבים בכל שלב במהלך ההליך מרגע העוברי של העכב...

בתרי Orofacial הם המומים המולדים craniofacial הדומיננטיים ביותר. כמו כן, לוקח בחשבון את כל פגמי craniofacial האפשריים, אלה הם האנומליה הלידה השנייה בשכיחותו בתינוקות 2. חיך שסוע להתרחש בכ -1 מכל 700 לידות בארצות הברית (ארה&quot;ב) בכל שנה, את השכיחות של חיך שסוע היא שווה 475 ילדים שנולדו עם חיך שסוע לחודש או 15 ילדים עם שסעים ליום 3. כ -1% מילדים שנולדו ברחבי העולם כל שנה תערוכת צורה כלשהי של dysmorphology craniofacial. בתרי החיך והשפה צריכים הליך מאוד יקר ומסובך עם השלכות לכל החיים לחולים שיש להם את האנומליה הזו. העלות המשוערת לכל מטופל עם שסוע פה היא כ -100,000 $ 4. הטיפול בחולה עם שפה שסועה דורשת צוות של רופאים, כולל רופאים, מומחי אוזן וגרון, גנטיקאים, מרדימים craniofacial,דיבור בשפת פתולוגים, תזונאים, orthodontists, prosthodontists, פסיכולוגים, נוירוכירורגים, ורופאי עיניים. בpalatogenesis, החך המשני נשאלת צמחים לזווג, אשר בתחילה לגדול בצורה אנכית ולעבור גובה מדף חיך מעל dorsum של הלשון. בעקבות העלאה, מדפי החך לזווג לגדול לכיוון קו האמצע (בE14.5 -E15 בעכברים ובשבוע 9 בבני אדם). אפיתל המדיאלי הקצה (MEE) המכסה את קצה המדף שומר יוצר תפר אפיתל קו האמצע. זה ואחריו אפיתל מעבר mesenchymal ו / או אפופטוזיס לאפשר מפגש mesenchymal. הידבקות של MEE המנוגדים היא אירוע חיוני שינוי שגורם לחיך שסוע. עם זאת, רק מעט מחקרים בחנו את ההידבקות הראשונית של מדפי חך 5. צורות החיך קשות על ידי התמיינות של תאי mesenchymal לתא עצם. ההתפתחות לא תקינה של החיך יכול לייצר מפתחלא חיך עם או בלי מעורבות של השפה. טכניקות תרבות איבר החיך היו בשימוש נרחב למעבדות רבות במהלך 30 השנים האחרונות 6,7. בפרוטוקול זה אנו מתארים בפרטי שיטה של ​​נתיחת חיך ותרבות איבר סטטי. היתרון של תרבות איבר חסרת תנועה הוא שהיא מאפשרת מדפי חך הפתיל. טכניקה זו הייתה בשימוש בהצלחה במעבדה שלנו לניסויי היתוך ואיתות רבים 8,9. עם זאת ההיקף של הטכניקה הוא עצום וניתן להשתמש בו בכל פעם שנדרשה מערכת תרבות איבר סטטי, כולל ההערכה של תגובות לחומרים כימיים אקסוגני, את ההשפעות של גורמי גדילת רגולציה במסלולים שונים וחלבונים ספציפיים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig1.jpg" /> ele סריקת איור 1. העכבר Palatogenesis. שלבי התפתחות של חיך העכברים. (BF)micrographs ctron (SEM) של החיך המשני בזמנים התפתחותי נציג. חיצים אדומים: להראות את החלק הראשוני של הידבקות חיך והיתוך. צהובים חצים: נקודה למרחב שבין החיך הראשי והמשני שייעלם לאחר ההיתוך (נדפס מ -11 קאופמן באישור PLoS ONE).

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BGJb</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza Inc.</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td>100x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well organ culture dish</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>#353037</td>
			<td>60x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire triangular grid</td>
			<td>Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filter</td>
			<td>GE&#38; Water and Process Technologies</td>
			<td>K04BP04700</td>
			<td>Black 0.4 micron, 47 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>ZEISS&#160; Stemi SR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture hood</td>
			<td>NUAIRE Laminar Flow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting forceps</td>
			<td>Dumont Medical&#160;</td>
			<td></td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS14003-G</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS500086</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Microdissecting scissors</td>
			<td rowspan="2">Kent Scientific Corporation</td>
			<td rowspan="2">INS14127-G</td>
			<td rowspan="2">Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical currete (spoon spatula)</td>
			<td>Hu-friedy</td>
			<td></td>
			<td>CM 2/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector laboratory hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Incubator</td>
			<td rowspan="3">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td>Farma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series11 water Jacket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023&#160;</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic Light source</td>
			<td>Fiber-light&#160; Dolan-Jenner</td>
			<td>PL-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassette&#160;</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>EC301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kim Wipes</td>
			<td rowspan="2">VWR</td>
			<td rowspan="2">470173-504</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method of studying palatal fusion using static organ culture

שפה שסועה היא בין הנפוצים ביותר של כל המומים המולדים. הצורות המשניות החיך ממדפי mesenchymal מכוסה באפיתל ששומרות על צורת תפר אפיתל קו האמצע (MES). התיאוריות מציעות כי תאי MES מעקב אפיתל מעבר mesenchymal (EMT), אפופטוזיס והגירה, מה שהופך את החיך התמזגו 1. התפוררות מוחלטת של MES היא השלב החיוני הסופי של מפגש חיך עם סובבי תאי mesenchymal. אנו מספקים שיטה לתרבות איבר החיך. פיתחו בפרוטוקול מבחנה מאפשר הלימוד של התהליכים הביולוגיים ומולקולריים במהלך היתוך. היישומים של טכניקה זו הם רבים, ובכלל זה תגובות הערכה לחומרים כימיים אקסוגני, השפעות של גורמים רגולטוריים וצמיחה וחלבונים ספציפיים. יש תרבות איבר חיך מספר היתרונות הכוללים מניפולציה בשלבים שונים של פיתוח, שאינו אפשרי באמצעות במחקרי vivo.

<html> הטכניקה יכולה להיות מיושמת על סוגים שונים של המחקר הבא experiments.The שונים נועד לבחון את ההשפעה של ניקוטין טרטוגניות במבחנה על היתוך חיך. שני זנים של עכברים שמשו לניסוי זה, CD1 ורקמת C57.Palatal טופל ב0.06 ו -6 מ&quot;מ ריכוזים של hemisulfate ניקוטין. היה נראה כי דפוסי היתוך חיך ועית?...

Watch this Scientific Journal Video about Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture at JoVE.com

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

מחקרים בהתפתחות חיך מונעים על ידי את השכיחות של חיך שסוע, מומים מולדים שמטיל נטל בריאותי עצום ויכולים להשאיר נמשך השחתה. אנו מדגימים כאן טכניקה למדפי חך התרבות שיכול לשמש כדי לחקור מסלולי איתות שונים מעורבים בפיתוח חיך והיתוך.

שיטה של ​​לימוד Palatal היתוך באמצעות סטטי איברים תרבות

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

method-of-studying-palatal-fusion-using-static-organ-culture

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.7K Views.  Texas A&M University Baylor College of Dentistry.  מחקרים בהתפתחות חיך מונעים על ידי את השכיחות של חיך שסוע, מומים מולדים שמטיל נטל בריאותי עצום ויכולים להשאיר נמשך השחתה. אנו מדגימים כאן טכניקה למדפי חך התרבות שיכול לשמש כדי לחקור מסלולי איתות שונים מעורבים בפיתוח חיך והיתוך. 

Video: Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

The use of reporter mice coupled to whole mount and section staining, microscopy and in vivo assays facilitates the analysis of mechanisms underlying the normal patterning of the respiratory tract. Here we describe how these techniques contributed to the analysis of Wnt signaling during tracheal development.

לימוד Wnt איתות במהלך דפוסים של איירווייס ניצוח

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

הדור של Parabiotic דג הזברה עוברים ידי Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

תרבות איברים שלמים הר Immunofluorescence מכתים של עכבר Wolffian צינוריות

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

3-מימדי אנגיוגנזה שיטת מערכת באמצעות Spheroids שיתוף תרבות נוצר על ידי ויוצרים מושבת המושבה תאים ותאי גזע Mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a three-dimensional system. Here we present a relatively straightforward and inexpensive method that yields brain organoids. In this protocol human pluripotent stem cells are broken into small clusters instead of single cells and grown in basic media without a heterologous basement membrane matrix or exogenous growth factors, allowing the intrinsic developmental cues to shape the organoid&#39;s growth. This simple system produces a diversity of brain cell types including glial and microglial cells, stem cells, and neurons of the forebrain, midbrain, and hindbrain. Organoids generated from this protocol also display hallmarks of appropriate temporal and spatial organization demonstrated by brightfield images, histology, immunofluorescence and real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Because these organoids contain cell types from various parts of the brain, they can be utilized for studying a multitude of diseases. For example, in a recent paper we demonstrated the use of organoids generated from this protocol for studying the effects of hypoxia on the human brain. This approach can be used to investigate an array of otherwise difficult to study conditions such as neurodevelopmental handicaps, genetic disorders, and neurologic diseases.

This protocol was generated as a means to produce brain organoids in a simplified, low cost manner without exogenous growth factors or basement membrane matrix while still maintaining the diversity of brain cell types and many features of cellular organization.

שיטת בימוי עצמי סטטי ליצירת אורגנואידים המוח מתאי גזע האדם העובריים

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion is the merger of two or more cells to form a single cell. Here we provide a protocol for cell fusion of two different cell types. Fused hybrid cells are enriched by flow cytometry-based sorting, followed by fluorescence microscopy of hybrid cell structure and function. Fluorescently tagged proteins generated by genome editing are imaged inside fused cells, allowing cellular structures to be identified based on fluorescence emission and referenced back to the cell type of origin. This robust and general method can be applied to different cell types or organelles of interest, to understand cellular structure and function across a range of fundamental biological questions.

The purpose of this protocol is to fuse two different cell types to create hybrid cells. Fluorescence microscopy analysis of fused cells is used to track the cell of origin of cellular organelles. This assay can be used to explore how cellular structure and function respond to perturbation by cell fusion.

תא תא פיוז'ן של הגנום בעריכה קווי תאים עבור פרטורבציה של מבנה הסלולר ותפקוד

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

שיטה של ​​לימוד Palatal היתוך באמצעות סטטי איברים תרבות

שיטה של לימוד Palatal היתוך באמצעות סטטי איברים תרבות