The authors do not have any acknowledgements.

설명하는 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 및 사용위원회의 사전 승인을 포함한 척추 동물의 사용에 대한 지침과 규정에 따라 수행해야합니다. 해부 악기와 문화 미디어 1. 준비 <ol><li> 예비 세탁 모든 악기는 3 %의 과산화수소와 20 분 동안 121 ℃에서 다음 오토 클레이브로 절개하여 사용할 수있다. 후드에서 진공 흡입으로 0.22 μm의 기공 크기의 필터를 사용하여 항생제와 항진균제 솔루션 BGJb 미디어를 필터링합니다. </li></ol> 문화 장비 2. 준비 <ol><li> 70 % 알코올 스프레이, 작은 삼각형의 구개 기관을 지원하는 폴리 카보네이트 멤브레인 필터를 잘라하고 건조 할 수 있습니다. 기관 배양 접시 위에 깨끗하고 살균 등변 삼각형 모양의 와이어 그리드 (20mm)를 배치하여 센터 - 글쎄 장기 배양 접시 (60x15 mm)를 준비합니다. 그 다음 B의 1 ㎖로 잘 채우기GJB 미디어 문화 미디어. 참고 : 용지가 입맛을 잠수없이 그리드의 수준에 도달하기에 충분해야한다. 실험에 .Depending 그리드의 상단에있는 멤브레인 필터, 아래 반짝이는면, (그리드 당 3 ~ 4 막)을 배치, 치료 (단백질, 항체 또는 억제제) 미디어에 추가 할 수 있습니다 </li></ol> 3. 마우스 배아 수집 및 문화에 대한 준비 <ol><li> 야생형 마우스 배아를 얻기 위해, 사용은 13.5 임신 한 CD-1 마우스 유전 적 배경의 피로를 시간이 초과되었습니다. 70 % 에탄올로 해부 영역을 청소합니다. 참고 : 마우스의 다른 균주를 사용할 수 있습니다. 때문에 우리는 더 큰 쓰레기 수의 CD-1 마우스를 선호합니다. </li><li> 승인 된 프로토콜을 사용하여 죽음을 보장하기 위해 자궁 경부 전위 다음에 5 %의 이소 플루 란 E13.5 DPC (일 성교를 게시)에서 임신 한 쥐를 안락사. </li><li> 악기에 복부 머리 스틱을 피하기 위해 복부 복부 표면에 70 % 에탄올 스프레이. 그리고 복부 복강을 엽니 다날카로운 무딘 운영 가위 마이크로 해부 집게를 사용하여 자궁을 찾습니다. 집게를 사용하여, 전체 자궁을 들어 올려 자궁 몸을 절단 및 광 운영 가위로 자궁 뿔의 끝을 몸에서 분리. </li><li> (관리 및 실험 동물의 사용을위한 프로토콜 가이드에 따르면) 얼음 위에 깨끗한 종이 타월에 자궁을 놓습니다. 오염을 방지하기 위해 다른 깨끗한 종이 타월로 자궁을 커버. 사용하기 전에 추가로 70 % 에탄올을 사용하여 스프레이기구를 살균. 자궁과 태아는 얼음에 실험실로 운반 할 수있다. </li><li> 오픈 층류 후드에서 신중하게 날카로운 무딘 운영 가위 마이크로 해부 집게를 사용하여 난황에 작은 구멍을합니다. 개방 폭 넓은 확인하고 부드럽게 난황에서 배아를 외면 화하다하기 위해 밀어 넣습니다. </li><li> 차가운 인산 완충 생리 식염수 1X (PBS)의 pH 7.4와 페트리 접시에 즉시 배아를 전송합니다. 적절한 단계, 예를 보장하기 위해몸체, 머리의 크기와 형태에 대한 사지 해부 현미경 배아 아민. 참고 : 개발의 오른쪽 단계에 있지 배아 실험에 사용되지 않습니다. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig2.jpg" /> 그림 2. 사지 버드 형태학은. 앞과 뒷다리는 숫자 사이의 웨빙 들여 쓰기의 정도를 검사한다. E13.5에서, 모든 자리 응축은 숫자 사이의 웨빙과 말초 들여 쓰기가 매우 뚜렷한 표시로, 눈에 띄는. 뒷 자리는 반 하루 뒤에 있습니다 (12) 상단 행 :. 앞다리, 낮은 행 : 뒷다리. 4. 미각 해부 <ol><li> 해부 현미경 PBS와 페트리 접시에 한 번에 하나의 배아를 놓습니다. 사용 작은 해부 가위와 핀셋은 태아의 몸에서 머리를 분리합니다. </li><li> 조심스럽게 집게와 눈높이 위의 마우스 두개골을 들고 (피상악 프로세스) 립 라인의 양측에 두 개의 절개를 만든다. 그리고 하악과 혀를 제거합니다. 눈 높이에서 절단하여 상악 프로세스 영역을 분리하고, 뇌, 눈, 코 중격 및 인접 조직을 제거합니다. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig3.jpg" /> 그림 3. 구개 조직이 입천장 선반이 상승했다 13.5 배아에서 수집하지만 연락을하지. 구개 선반이 정적 모델에서 72 시간 동안 공기 미디어 인터페이스에서 필터에 장기 문화에 넣었다. (A) 수준 E13.5 배아에 해부. (B) 블루 스타 해부 동안 집게로 조직을 유지하기 위해 지역의 경계. 사다리꼴 필터 멤브레인에 배치 해부 구개 선반 (C)보기. 배양 접시의 (D) 측면 뷰를 배치 한 후 해부 입맛과 문화 미디어의 추가. <ol start="3"><li> 후방에 전방에서 동양을 돕기 위해 첨부 된 기본 미각을 유지, 구개 구강 측면을 놓고 비중격과 주위 조직을 제거합니다. 숟가락 주걱을 사용하여 매우 신중하게 배양 접시에 그리드에 준비된 필터에 (코 쪽 아래) 구개 선반을 전송합니다. 주 : 적절한 공기 미디어 인터페이스를 허용하는 미디어의 볼륨을 조절합니다. </li><li> 스테레오 현미경, 기본 미각을 해부하고 서로 가까이 구개 선반을 배치 핀셋을 사용합니다. 그들이 접촉에 배치되지 않은 경우 구개 선반 융합되지 않습니다. 입천장의 앞쪽 부분이있는 삼각형의 멤브레인 필터를 잘라. 사다리꼴 모양은 미각의 앞쪽 부분을 국산화에 도움이됩니다. </li><li> 배양 구개 가구 단독으로 또는 2 종 BGJb 배양 배지를 사용하여 동일한 기관 배양 접시에 3 개. </li></ol> 5. 배양 마우스 구개 선반 <ol><li> tissu을 품어72 시간 동안 가습 가스 혼합물 (5 % CO 2, 95 % 공기)에서 37 ° C에서 ES, 그리고 매체마다 24 시간을 변경합니다. </li></ol> 조직 학적 분석 6. 미각 처리 <ol><li> / N은 ​​4 °에서 4 % 포름 알데히드 / 인산염 완충 생리 식염수 O와 문화에 72 시간 후 입맛을 수정 &#160; C. 그런 다음, 부드럽게 전송 피펫 PBS로 배양 접시에 조직을 씻는다. 카세트를 포함에 실험실 와이프과 장소의 조각에 입맛을 감싸. 참고 : 실험실 와이프의 입맛 포장은 탈수 과정에서 자신의 손실을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 70 %, 80 % 및 다음과 같은 정규 파라핀 매립 절차이어서 1 시간 동안 100 % 에탄올 세척, 최대 조직 탈수. 내장의 경우, 트레이에 직면 미각의 앞쪽 부분을 놓습니다. </li><li> 전치부에서 관상 방향으로 직렬 6 μm의 섹션을 잘라. 전체 섹션 미각은 350-450 섹션에 ì을 얻을 것입니다기능. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E). 10 점수 앞서 설명한 평균 퓨전 점수를 사용하여 매 20 번째 섹션 (MFS) 규모 (표 1)와 섹션을 얼룩. (8) </li></ol>

<ol>
	<li>Nawshad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+seam+disintegration+to+die+or+not+to+die+that+is+no+longer+the+question.">Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).</li><li>Strong, E. B., Buckmiller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+the+cleft+palate.">Management of the cleft palate.</a> Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).</li><li>Witt, P. D., Marsh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+assessing+outcome+of+surgical+repair+of+cleft+lip+and+cleft+palate.">Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate.</a> Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).</li><li>4miloro, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).</li><li>Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+epithelial+adhesion+molecule+CEACAM1+is+important+for+palate+formation.">Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation.</a> PloS one. 8, e61653 (2013).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro+an+analysis+by+DiI+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy.</a> Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).</li><li>Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+cultured+palatal+shelves+from+alligator+chick+and+mouse+embryos.">Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos.</a> The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).</li><li>San Miguel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin+reverse+signaling+controls+palate+fusion+via+a+PI3+kinase+dependent+mechanism.">Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).</li><li>Kang, P., Svoboda, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI+3+kinase+activity+is+required+for+epithelial+mesenchymal+transformation+during+palate+fusion.">PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).</li><li>RD, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Taher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+of+murine+limb+development.">Global gene expression analysis of murine limb development.</a> PloS one. 6, e28358 (2011).</li></ol>

The authors do not have any competing financial interests.

이 문서의 프로토콜은 배아 일 13.5에서 배아에서 구개 선반을 해부하는 방법을 제공한다. 마우스 배아 구개 가구는 37 ° C에서 95 % O 2, 5 % CO 2 분위기하에 무 혈청 배지에서 배양 하였다. 성공적인 구개 해부는 문화의 완료에 안락사 쥐의 배아 시간의 절차를 수행하는 동안 각 단계에서 여러 요인에 결정적으로 의존한다. 구개 융합을 좌우하는 가장 중요한 요소 중 하나는 기관 배양...

구강 안면 쪼개진 조각은 가장 지배적 인 두개 안면 기형이다. 또한, 고려 모든 가능한 두개 안면 결함을 가지고,이 신생아 2에서 두 번째로 가장 흔한 선천성 기형이다. 구개 파열은 약 1 미국 (US) 매년마다 700 출생에서 발생, 구개열의 발생 빈도는 갈라진 달에 입맛 또는 3 일 당 쪼개진 조각 15 아이들과 함께 탄생 475 어린이와 동일하다. 어린이의 약 1 %가 매년 전시를 전세계 두개 안면 dysmorphology 어떤 형태의 탄생. 입천장과 입술의 갈라진 틈이 이상이 환자의 평생의 의미와 매우 비싸고 복잡한 절차가 필요합니다. 구강 갈라진 각 환자에 대한 예상 비용은 약 $ 100,000 4입니다. 구순 구개열 환자의 치료는, 두개 안면 외과, 이비인후과, 유전 학자, 마취를 포함하여 의사의 팀이 필요합니다음성 언어 병리학 자, 영양사, 치열 교정, 보철, 심리학자, 신경 외과 및 안과. palatogenesis에서 보조 구개는 처음에 수직으로 성장하고 혀의 배부 위에 구개 선반 높이를 받아야 쌍의 outgrowths로 발생한다. 해발 고도에 따라, 한 쌍의 구개 선반 (인간의 마우스에서 E14.5 -E15에서와 주 9) 중간 선을 향해 성장한다. 선반 팁을 포함 내측 가장자리 상피 (MEE)는 중간 선 상피 솔기를 형성 준수합니다. 이것은 간엽 합류 할 수 있도록 중간 엽 전이 및 / 또는 아폽토시스에 의해 상피 이어진다. 반대 MEE의 접착은 그 변경 구개 파열을 일으키는 중요한 이벤트입니다. 그러나, 몇몇 연구는 구개 ​​선반 (5)의 초기 접착력을 조사 하였다. 조골 세포로 중간 엽 세포의 분화에 의해 하드 구개 형성한다. 음자리표를 생산할 수있는 미각의 이상 개발T와 함께 또는 입술의 개입없이 입맛. 미각 기관 배양 기술은 지난 30 년 동안 많은 실험실 -6,7- 위해 널리 사용되었다. 이 프로토콜에서 우리는 세부 사항에 구개 해부 및 정적 기관 배양하는 방법을 설명합니다. 움직 기관 배양의 장점은 선반 구개 융합 할 수 있다는 것이다. 이 기술은 많은 융합 및 신호 실험 8,9에 대한 우리의 실험실에서 성공적으로 사용되었다. 기술의 범위는 광대 한 정적 기관 배양 물 시스템은 외인성 화학 물질에 대한 반응의 평가를 포함하여, 필요할 때마다 이용 될 수 있지만, 다른 경로 및 특정 단백질 규제 성장 인자의 효과. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig1.jpg" /> 그림 1. 마우스 Palatogenesis. 쥐의 미각의 발달 단계. (BF) 스캔 ELE대표 발달 시간에 차 구개의 ctron 현미경 (SEM). 빨간색 화살표 : 구개 부착 및 융합의 초기 부분을 보여줍니다. 노란색 화살표 : 융합 후 사라집니다 기본 및 보조 입맛 사이의 공간에 포인트 (PLoS의 하나의 허가 카우프만 (11)에서 재 인쇄).

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BGJb</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza Inc.</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td>100x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well organ culture dish</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>#353037</td>
			<td>60x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire triangular grid</td>
			<td>Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filter</td>
			<td>GE&#38; Water and Process Technologies</td>
			<td>K04BP04700</td>
			<td>Black 0.4 micron, 47 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>ZEISS&#160; Stemi SR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture hood</td>
			<td>NUAIRE Laminar Flow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting forceps</td>
			<td>Dumont Medical&#160;</td>
			<td></td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS14003-G</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS500086</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Microdissecting scissors</td>
			<td rowspan="2">Kent Scientific Corporation</td>
			<td rowspan="2">INS14127-G</td>
			<td rowspan="2">Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical currete (spoon spatula)</td>
			<td>Hu-friedy</td>
			<td></td>
			<td>CM 2/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector laboratory hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Incubator</td>
			<td rowspan="3">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td>Farma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series11 water Jacket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023&#160;</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic Light source</td>
			<td>Fiber-light&#160; Dolan-Jenner</td>
			<td>PL-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassette&#160;</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>EC301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kim Wipes</td>
			<td rowspan="2">VWR</td>
			<td rowspan="2">470173-504</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method of studying palatal fusion using static organ culture

구순 구개열은 모든 출생 결함의 가장 흔한 중입니다. 중간 선 상피 솔기를 형성하기 위해 부착 상피로 덮여 중간 엽 선반에서 보조 구개 형태​​ (MES). 이론은 MES 세포 융합 미각 (1)을, 중간 엽 전이 (EMT), 세포 사멸 및 마이그레이션 상피를 수행하는 것이 좋습니다. MES의 전체 붕괴는 중간 엽 세포를 둘러싼 구개 합류의 마지막 필수 단계입니다. 우리는 구개 장기 배양 방법을 제공한다. 체외 프로토콜 개발이 융합 동안 생물학적 및 분자 프로세스의 연구를 할 수 있습니다. 이 기술의 응용 프로그램은 외인성 화학 약품에 대한 평가 응답, 규제 및 성장 요인과 특정 단백질의 효과를 포함, 수많은 있습니다. 구개 기관 배양 물이 생체 내 연구에서 사용 불가능 개발의 다른 단계에서의 조작을 포함하여 다수의 이점을 갖는다.

기술이 연구 experiments.The 다음의 다른 종류에 적용될 수는 구개 융합에 체외 니코틴 기형 효과를 시험하기 위해 설계되었다. 마우스의 두 균주는이 실험에 이용 된, CD1 및 C57.Palatal 조직 니코틴 헤미 0.06 및 6 mM의 농도로 처리 하였다. 그것은 구개 융합 패턴 및 타이밍이 서로 다른 두 균주에서 다르다는 것을 관찰 하였다. CD1 쥐에서, 대조군 구개 가구는 시간 의존적 방식으로 융합을 계속했?...

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Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

구개 개발의 연구는 구개열, 엄청난 의료 부담을 부과하고 외관을 손상하는 지속 남길 수 있습니다 출생 결함의 발생에 의해 좌우된다. 우리는 여기서 구개 개발 및 융합에 관련된 다른 신호 경로를 연구하기 위해 사용될 수있다 배양 구개 선반 기술을 보여준다.

정적 장기 문화를 사용하여 구개 퓨전 공부의 방법

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.7K 조회수.  Texas A&M University Baylor College of Dentistry.  구개 개발의 연구는 구개열, 엄청난 의료 부담을 부과하고 외관을 손상하는 지속 남길 수 있습니다 출생 결함의 발생에 의해 좌우된다. 우리는 여기서 구개 개발 및 융합에 관련된 다른 신호 경로를 연구하기 위해 사용될 수있다 배양 구개 선반 기술을 보여준다. 

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Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

연구

발생학

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

The use of reporter mice coupled to whole mount and section staining, microscopy and in vivo assays facilitates the analysis of mechanisms underlying the normal patterning of the respiratory tract. Here we describe how these techniques contributed to the analysis of Wnt signaling during tracheal development.

실시 항공의 패터닝 동안 Wnt 신호를 공부

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Blastulae 개발의 외과 융합에 의해 Parabiotic 제브라 피쉬 배아의 생성

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

오르간 문화와 마우스 Wolffian 덕트의 전체 마운트 면역 형광 염색법

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Organotypic 문화 메서드 배아 치킨 조직 개발 연구를

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a three-dimensional system. Here we present a relatively straightforward and inexpensive method that yields brain organoids. In this protocol human pluripotent stem cells are broken into small clusters instead of single cells and grown in basic media without a heterologous basement membrane matrix or exogenous growth factors, allowing the intrinsic developmental cues to shape the organoid&#39;s growth. This simple system produces a diversity of brain cell types including glial and microglial cells, stem cells, and neurons of the forebrain, midbrain, and hindbrain. Organoids generated from this protocol also display hallmarks of appropriate temporal and spatial organization demonstrated by brightfield images, histology, immunofluorescence and real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Because these organoids contain cell types from various parts of the brain, they can be utilized for studying a multitude of diseases. For example, in a recent paper we demonstrated the use of organoids generated from this protocol for studying the effects of hypoxia on the human brain. This approach can be used to investigate an array of otherwise difficult to study conditions such as neurodevelopmental handicaps, genetic disorders, and neurologic diseases.

This protocol was generated as a means to produce brain organoids in a simplified, low cost manner without exogenous growth factors or basement membrane matrix while still maintaining the diversity of brain cell types and many features of cellular organization.

인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 정적 자기 지향 방법

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion is the merger of two or more cells to form a single cell. Here we provide a protocol for cell fusion of two different cell types. Fused hybrid cells are enriched by flow cytometry-based sorting, followed by fluorescence microscopy of hybrid cell structure and function. Fluorescently tagged proteins generated by genome editing are imaged inside fused cells, allowing cellular structures to be identified based on fluorescence emission and referenced back to the cell type of origin. This robust and general method can be applied to different cell types or organelles of interest, to understand cellular structure and function across a range of fundamental biological questions.

The purpose of this protocol is to fuse two different cell types to create hybrid cells. Fluorescence microscopy analysis of fused cells is used to track the cell of origin of cellular organelles. This assay can be used to explore how cellular structure and function respond to perturbation by cell fusion.

세포 구조 및 기능의 교란을 위해 게놈 편집 된 세포주 세포주 간의 세포 융합

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...