The authors do not have any acknowledgements.

Toutes les procédures décrites doivent être effectuées en conformité avec les directives et règlements pour l&#39;utilisation d&#39;animaux vertébrés, y compris l&#39;approbation préalable par le Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux locale. 1. Préparation des instruments de dissection et Culture Media <ol><li> Prélavage tous les instruments à utiliser dans la dissection avec 3% de peroxyde d&#39;hydrogène, puis autoclave à 121 ° C pendant 20 min. Filtre BGJb support avec une solution antibiotique et antimycotique en utilisant un filtre de 0,22 um de taille de pore avec aspiration par le vide dans une hotte. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;équipement Culture <ol><li> Couper filtres à membrane de polycarbonate qui soutiendront les organes palatines en petits triangles, pulvériser avec 70% d&#39;alcool et laissez-les sécher. Préparer Centre-Well Organ Culture Dish (60x15 mm) en plaçant une grille propre et stérilisée triangle équilatéral-forme de fil (20 mm) sur la plaque de culture de l&#39;orgue. Ensuite, remplissez le puits avec 1 ml de BGJB milieux de culture des médias. NOTE: Les médias devraient être suffisantes pour atteindre le niveau de la grille sans submerger les palais. Placez les filtres à membrane, côté brillant vers le bas, sur le dessus de la grille (3-4 membranes par grille) .Depending sur l&#39;expérience, de traitement (protéines, anticorps ou inhibiteurs) peuvent être ajoutés aux médias </li></ol> 3. Mouse Embryo prélèvement et la préparation de la Culture <ol><li> Pour obtenir des embryons de souris de type sauvage, l&#39;utilisation chronométré 13,5 enceinte souris CD-1 souche de fond génétique. Nettoyer la zone de dissection avec 70% d&#39;éthanol. REMARQUE: Les autres souches de souris peuvent être utilisés. Nous préférons souris CD-1 en raison du nombre plus grand de la litière. </li><li> Euthanasier les souris enceintes à E13.5 DPC (jours après le coït) avec 5% d&#39;isoflurane suivie par dislocation cervicale pour assurer la mort en utilisant des protocoles approuvés. </li><li> Vaporiser éthanol à 70% sur la surface abdominale ventrale pour éviter d&#39;avoir les cheveux abdominale bâton pour les instruments. Puis ouvrir la cavité abdominale ventraleutilisant un pointus-blunt ciseaux d&#39;exploitation et de micro-pinces à disséquer pour localiser l&#39;utérus. Utilisation de la pince, soulever l&#39;ensemble de l&#39;utérus et le séparer du corps de coupe au niveau du corps de l&#39;utérus et à la pointe des cornes utérines avec une lumière ciseaux de fonctionnement. </li><li> Placez l&#39;utérus sur une serviette en papier propre sur de la glace (Selon le guide de protocole pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire). Couvrir l&#39;utérus avec une autre serviette de papier propre pour éviter la contamination. Stériliser les instruments utilisant 70% d&#39;éthanol pulvérisation avant l&#39;utilisation ultérieure. L&#39;utérus et les embryons peuvent être transportés au laboratoire sur de la glace. </li><li> Dans une hotte à flux laminaire ouverte, assurez attentivement une petite ouverture dans le sac jaune avec des ciseaux d&#39;exploitation nettes et les micro-blunt-pinces à disséquer. Faire l&#39;ouverture plus large, puis poussez-le doucement d&#39;extérioriser l&#39;embryon de la vésicule ombilicale. </li><li> Transférer les embryons immédiatement à une boîte de Pétri avec froid saline tamponnée au phosphate 1X (PBS) pH 7,4. Pour assurer le bon stade, exl&#39;embryon amine sous un microscope à dissection pour le corps, la taille de la tête et du membre morphologie. NOTE: Les embryons qui ne sont pas au bon stade de développement ne sont pas utilisés pour l&#39;expérience. </li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig2.jpg" /> Figure 2. Limb Bud Morphologie. L&#39;avant et membres postérieurs sont vérifiés pour le degré de sangle indentation entre les chiffres. À E13.5, tous les condensations chiffres sont de premier plan, avec la sangle et indentations distales entre les chiffres apparaissant très distincte. Les chiffres de derrière sont derrière par une demi-journée 12 Rangée supérieure:. Membres antérieurs, rangée inférieure: membre postérieur. 4. Bouche Dissection <ol><li> Placer un embryon à la fois dans une boîte de Pétri avec du PBS sous le microscope à dissection. Utilisation de petits ciseaux de dissection et pincettes séparer la tête du corps de l&#39;embryon. </li><li> Tenant délicatement le crâne de la souris au-dessus du niveau des yeux avec une pince (en évitantle processus maxillaire) faire deux incisions sur les deux côtés de la ligne de la lèvre. Ensuite, retirer la mandibule et la langue. Isoler la région de processus maxillaire en faisant une coupure au niveau des yeux et retirer le cerveau, les yeux, la cloison nasale et des tissus attenants. </li></ol><img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig3.jpg" /> Figure tissus 3. Bouche recueillies auprès 13,5 embryons, lorsque les rayons du palais avaient élevées mais pas en contact. Les étagères palatines ont été mises en culture d&#39;organes sur un filtre à l&#39;interface des médias de l&#39;air pendant 72 heures dans le modèle statique. (A) Niveau de dissection sur E13.5 embryons. (B) Blue Stars délimitent les zones à maintenir le tissu avec une pince lors de la dissection. (C) Vue de lames palatines disséqués placés sur une membrane filtrante de trapèze. (D) Vue de côté de la boîte de culture après le placement de la palais disséqués et plus de milieux de culture. <ol start="3"><li> Placez le côté orale palatine et retirer la cloison nasale et le tissu autour d&#39;elle, en gardant le palais primaire fixé pour l&#39;aider à orienter d&#39;avant en arrière. Utilisez une spatule en cuillère et transférer très soigneusement les étagères palatines (côté nasal bas) pour les filtres préparés sur les grilles dans les boîtes de culture. REMARQUE: Régler le volume des médias pour permettre interface appropriée air-médias. </li><li> Sous le microscope stéréo, disséquer le palais primaire et utiliser des pinces pour placer les étagères palatines près de l&#39;autre. Les étagères palatines ne seront pas fusionner si elles ne sont pas mises en contact. Couper le filtre à membrane triangulaire où la partie antérieure du palais est situé. La forme trapézoïdale aidera à localiser la partie antérieure du palais. </li><li> Culture les étagères palatines individuellement ou avec deux ou trois dans la même boîte de culture d&#39;organes, selon BGJb milieux de culture. </li></ol> 5. La culture souris Tablettes palatines <ol><li> Incuber le tissues à 37 ° C dans un mélange de gaz humidifié (CO 2 et 95% d&#39;air de 5%) pendant 72 heures, et de changer le milieu tous les 24 heures. </li></ol> 6. Traitement Palais pour l&#39;analyse histologique <ol><li> Fixer les palais après 72 h en culture avec 4% de formaldéhyde / tampon phosphate salin O / N à 4 ° &#160; C. Puis, doucement avec une pipette de transfert laver le tissu dans la boîte de culture avec du PBS. Enveloppez les palais dans un morceau de lingettes de laboratoire et dans l&#39;intégration des cassettes. REMARQUE: Emballage dans les palais des lingettes de laboratoire à prévenir leur perte au cours du processus de déshydratation. </li><li> Déshydrater le tissu après 70%, 80% et jusqu&#39;à 100% de lavages d&#39;éthanol pendant 1 heure, suivi par la procédure régulière de paraffine d&#39;intégration. Pour l&#39;enrobage, placer la partie antérieure du palais face au plateau. </li><li> Couper 6 um sections en série dans l&#39;orientation coronale d&#39;avant en arrière. Une section complète du palais donnera 350-450 sections. Colorer les sections avec hématoxyline et l&#39;éosine (H &amp; E). 10 Score chaque section 20 ème utilisant le décrit précédemment Score Fusion Mean (MFS) échelle (tableau 1). 8 </li></ol>

<ol>
	<li>Nawshad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+seam+disintegration+to+die+or+not+to+die+that+is+no+longer+the+question.">Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).</li><li>Strong, E. B., Buckmiller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+the+cleft+palate.">Management of the cleft palate.</a> Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).</li><li>Witt, P. D., Marsh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+assessing+outcome+of+surgical+repair+of+cleft+lip+and+cleft+palate.">Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate.</a> Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).</li><li>4miloro, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).</li><li>Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+epithelial+adhesion+molecule+CEACAM1+is+important+for+palate+formation.">Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation.</a> PloS one. 8, e61653 (2013).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro+an+analysis+by+DiI+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy.</a> Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).</li><li>Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+cultured+palatal+shelves+from+alligator+chick+and+mouse+embryos.">Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos.</a> The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).</li><li>San Miguel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin+reverse+signaling+controls+palate+fusion+via+a+PI3+kinase+dependent+mechanism.">Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).</li><li>Kang, P., Svoboda, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI+3+kinase+activity+is+required+for+epithelial+mesenchymal+transformation+during+palate+fusion.">PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).</li><li>RD, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Taher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+of+murine+limb+development.">Global gene expression analysis of murine limb development.</a> PloS one. 6, e28358 (2011).</li></ol>

The authors do not have any competing financial interests.

Le protocole à cet article fournit une méthode de disséquer étagères palatines à partir d&#39;embryons au jour embryonnaire 13,5. Étagères palatines des embryons de souris ont été cultivées dans un milieu de culture exempt de sérum dans une atmosphère de 95% d&#39;O 2 5% de CO2 à 37 ° C. Palatal dissection réussie dépend de manière critique de plusieurs facteurs, à chaque étape au cours de la procédure à partir du moment embryonnaire des souris euthanasiés à la fin de la culture. Un de...

Fentes faciales sont prédominants défauts de naissance les cranio-faciales. Aussi, en prenant en considération tous les défauts cranio-faciales possibles, ceux-ci sont la deuxième anomalie de naissance le plus commun chez les nouveaux nés 2. Fentes palatines se produisent à environ 1 pour 700 naissances aux États-Unis (US) chaque année, l&#39;incidence de la fente palatine est égale à 475 enfants nés avec une fente palatine par mois ou 15 enfants atteints de fentes par jour 3. Environ 1% des enfants nés dans le monde chaque année présentent une certaine forme de dysmorphie cranio-faciale. Fentes du palais et la lèvre ont besoin d&#39;une procédure très coûteuse et complexe avec des implications pour la vie pour les patients qui ont cette anomalie. Le coût estimé pour chaque patient avec fente orale est d&#39;environ 100 000 $ 4. Le traitement d&#39;un patient avec fente labiale et palatine nécessite une équipe de médecins, y compris cranio-faciales chirurgiens, orl, des généticiens, des anesthésistes,-orthophonistes, des nutritionnistes, des orthodontistes, prothésistes, des psychologues, des neurochirurgiens, et les ophtalmologistes. Dans palatogenesis, le palais secondaire se pose excroissances paires, qui se développent d&#39;abord verticalement et subissent palatine plateau élévation au-dessus du dos de la langue. Après l&#39;élévation, les étagères palatines appariés poussent vers la ligne médiane (à E14.5 -E15 chez la souris et chez l&#39;homme la semaine 9). L&#39;épithélium de bord médial (MEE) qui couvre la pointe du plateau adhère formant la couture médiane épithéliale. Ceci est suivi par transition épithélio-mésenchymateuse et / ou de l&#39;apoptose pour permettre mésenchymateuses confluence. Adhésion d&#39;opposer MEE est un événement essentiel dont l&#39;altération provoque une fente palatine. Cependant, peu d&#39;études ont étudié l&#39;adhérence initiale des lames palatines 5. Les formes palais dur par la différenciation des cellules mésenchymateuses en ostéoblastes de. Le développement anormal du palais peut produire cleft palais avec ou sans la participation de la lèvre. Techniques de culture d&#39;organes palais avaient été largement utilisés pour de nombreux laboratoires au cours des 30 dernières années 6,7. Dans ce protocole, nous décrivons en détail une méthode de dissection palatine et de la culture d&#39;organe statique. L&#39;avantage d&#39;une culture d&#39;organe immobile est qu&#39;il permet de fusionner étagères palatines. Cette technique a été utilisée avec succès dans notre laboratoire pour de nombreuses fusion et de signalisation expériences 8,9. Toutefois, le champ d&#39;application de la technique est très grande et peut être utilisé chaque fois que système de culture d&#39;organe statique est nécessaire, y compris l&#39;évaluation des réponses à des agents chimiques exogènes, les effets de facteurs de croissance dans différentes voies de régulation et des protéines spécifiques. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig1.jpg" /> Figure 1. Souris Palatogenesis. Les stades de développement de la bouche de souris. (BF) ele de numérisationmicrographies cTRON (SEM) du palais secondaire à des moments représentatifs de développement. Les flèches rouges montrent: la partie initiale de l&#39;adhésion palatine et de la fusion. Les flèches jaunes: le point à l&#39;espace entre les palais primaires et secondaires qui vont disparaître après la fusion (Repris de Kaufman 11 avec la permission de la revue PLoS ONE).

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BGJb</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza Inc.</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td>100x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well organ culture dish</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>#353037</td>
			<td>60x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire triangular grid</td>
			<td>Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filter</td>
			<td>GE&#38; Water and Process Technologies</td>
			<td>K04BP04700</td>
			<td>Black 0.4 micron, 47 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>ZEISS&#160; Stemi SR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture hood</td>
			<td>NUAIRE Laminar Flow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting forceps</td>
			<td>Dumont Medical&#160;</td>
			<td></td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS14003-G</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS500086</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Microdissecting scissors</td>
			<td rowspan="2">Kent Scientific Corporation</td>
			<td rowspan="2">INS14127-G</td>
			<td rowspan="2">Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical currete (spoon spatula)</td>
			<td>Hu-friedy</td>
			<td></td>
			<td>CM 2/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector laboratory hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Incubator</td>
			<td rowspan="3">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td>Farma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series11 water Jacket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023&#160;</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic Light source</td>
			<td>Fiber-light&#160; Dolan-Jenner</td>
			<td>PL-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassette&#160;</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>EC301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kim Wipes</td>
			<td rowspan="2">VWR</td>
			<td rowspan="2">470173-504</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method of studying palatal fusion using static organ culture

Fente labiale et palatine sont parmi les plus communs de toutes les anomalies congénitales. Les formes de palais secondaire des tablettes mésenchymateuses couverts par un épithélium qui adhère à former la couture médiane épithéliale (MES). Les théories suggèrent que les cellules MES suivent une transition épithélio-mésenchymateuses (EMT), l&#39;apoptose et la migration, faisant un palais fusionné 1. Désintégration complète du MES est la phase essentielle finale de palatine confluence avec entourant les cellules mésenchymateuses. Nous fournissons une méthode de culture d&#39;organe de palais. Le point dans le protocole vitro permet l&#39;étude des processus biologiques et moléculaires lors de la fusion. Les applications de cette technique sont nombreux, y compris les réponses à l&#39;évaluation des agents chimiques exogènes, des effets des facteurs réglementaires et de croissance et des protéines spécifiques. Culture d&#39;organe palatine a un certain nombre d&#39;avantages, y compris la manipulation à différents stades de développement qui est pas possible en utilisant des études in vivo.

La technique peut être appliquée à différents types de experiments.The étude suivante a été conçu pour tester l&#39;effet tératogène de la nicotine in vitro sur palatine fusion. Deux souches de souris ont été utilisées pour cette expérience, CD1 et C57.Palatal tissu a été traitée avec 0,06 mM et 6 concentrations de nicotine hémisulfate. Il a été observé que les schémas de fusion palatines et le calendrier étaient différents dans les deux souches différentes. Chez la souris CD1, des éta...

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Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Des études de développement du palais sont motivés par l&#39;incidence de la fente palatine, un défaut de naissance qui impose un fardeau de santé énorme et peut laisser durablement défigurée. Nous démontrons ici d&#39;une technique de culture étagères palatines qui peuvent être utilisés pour étudier différentes voies de signalisation impliquées dans le développement palatine et de la fusion.

Méthode d&#39;étude Palatal Fusion utilisant statique Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.7K vues.  Texas A&M University Baylor College of Dentistry.  Des études de développement du palais sont motivés par l'incidence de la fente palatine, un défaut de naissance qui impose un fardeau de santé énorme et peut laisser durablement défigurée. Nous démontrons ici d'une technique de culture étagères palatines qui peuvent être utilisés pour étudier différentes voies de signalisation impliquées dans le développement palatine et de la fusion. 

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Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

The use of reporter mice coupled to whole mount and section staining, microscopy and in vivo assays facilitates the analysis of mechanisms underlying the normal patterning of the respiratory tract. Here we describe how these techniques contributed to the analysis of Wnt signaling during tracheal development.

Étude Wnt Signaling Pendant Patterning de Conduite Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Recherche

Biologie du développement

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Génération de parabiose Zebrafish Embryons par Fusion chirurgicale de développement blastulas

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Production à grande échelle de cardiomyocytes à partir pluripotentes humaines cellules souches en utilisant un petit protocole Différenciation Molecule-Based hautement reproductible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

Organ Culture et Mont entiers immunofluorescence de souris Conduits Wolffian

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagerie en direct de la souris Fusion de palais secondaire

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Méthode de Culture organotypique pour étudier le développement des tissus embryonnaires de poulet

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Système d'analyse d'angiogenèse tridimensionnel utilisant des sphéroïdes de co-culture formés par des cellules de formation de colonies endothéliales et des cellules souches mésenchymales

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a three-dimensional system. Here we present a relatively straightforward and inexpensive method that yields brain organoids. In this protocol human pluripotent stem cells are broken into small clusters instead of single cells and grown in basic media without a heterologous basement membrane matrix or exogenous growth factors, allowing the intrinsic developmental cues to shape the organoid&#39;s growth. This simple system produces a diversity of brain cell types including glial and microglial cells, stem cells, and neurons of the forebrain, midbrain, and hindbrain. Organoids generated from this protocol also display hallmarks of appropriate temporal and spatial organization demonstrated by brightfield images, histology, immunofluorescence and real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Because these organoids contain cell types from various parts of the brain, they can be utilized for studying a multitude of diseases. For example, in a recent paper we demonstrated the use of organoids generated from this protocol for studying the effects of hypoxia on the human brain. This approach can be used to investigate an array of otherwise difficult to study conditions such as neurodevelopmental handicaps, genetic disorders, and neurologic diseases.

This protocol was generated as a means to produce brain organoids in a simplified, low cost manner without exogenous growth factors or basement membrane matrix while still maintaining the diversity of brain cell types and many features of cellular organization.

Une méthode statique auto-dirigée pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches embryonnaires humaines

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion is the merger of two or more cells to form a single cell. Here we provide a protocol for cell fusion of two different cell types. Fused hybrid cells are enriched by flow cytometry-based sorting, followed by fluorescence microscopy of hybrid cell structure and function. Fluorescently tagged proteins generated by genome editing are imaged inside fused cells, allowing cellular structures to be identified based on fluorescence emission and referenced back to the cell type of origin. This robust and general method can be applied to different cell types or organelles of interest, to understand cellular structure and function across a range of fundamental biological questions.

The purpose of this protocol is to fuse two different cell types to create hybrid cells. Fluorescence microscopy analysis of fused cells is used to track the cell of origin of cellular organelles. This assay can be used to explore how cellular structure and function respond to perturbation by cell fusion.

Fusion cellulaire du génome Lignes cellulaires modifiées pour la perturbation de la structure et de la fonction cellulaires

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Différenciation neuronale efficace à l'aide de la culture monocellulaire des cellules souches embryonnaires humaines

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...