هذا اللغز يمكن أن تساعد في الإجابة على بعض الأسئلة في مجال بيولوجيا الخلية مثل البروتين المدخلات في الكلوروبلاست. والميزة الرئيسية لهذه التكنولوجيا هي أن مدخلات البروتين في الكلوروبلاستس يمكن أن تدرس في ظروف الجسم الحي. إثبات الإجراء سيكون جونهو لي وهيانغجو كانغ، اثنين من خارج وظيفة من مختبري.
للبدء، حصاد أنسجة أوراق سليمة من النباتات التي يبلغ عمرها أسبوعين من واحد إلى اثنين من لوحات B5. استخدام سكين الجراحية لحصاد الأوراق ووضعها في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر تحتوي على 25 ملليلتر من محلول انزيم. ضع الأنبوب أفقيًا على شاكر دوار وحضن بالتحريض اللطيف عند 22 درجة مئوية في الظلام لمدة ثماني إلى 12 ساعة حتى تبقى السيقان والسيقان فقط في الحل.
بعد الانتهاء من الحضانة، فلتر محلول الإنزيم الذي يحتوي على البروتبلاستس المفرج عنه من خلال شبكة بحجم مسام 140 ميكرومتر في طبق بيتري جديد. ثم طبقة بعناية الحل على رأس 15 ملليلتر من محلول السكروز 21٪في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. الطرد المركزي الأنبوب في الدوار دلو يتأرجح في 98 gs لمدة 10 دقائق مع أدنى إعدادات التسارع والتباطؤ.
بعد ذلك، استخدم ماصة باتورا لإزالة بعناية الضمورات من الطبقة العليا التي تحتوي على محلول الإنزيم ومن الواجهة بين محلول الإنزيمات وحل السكروز. نقل هذا الحل إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر يحتوي على 30 ملليلتر من محلول W5 وعكس أنبوب لخلط. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 51 gs لمدة ست دقائق.
استخدام ماصة لتجاهل هذا افرا بعناية دون إزعاج protoplasts في بيليه. إضافة 25 ملليلتر من حل W5 وبلطف إعادة تعليق الضمور. لتحقيق الاستقرار، احتضان في ثلاجة أربعة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.
بعد أربع درجة مئوية الحضانة، بيليه الدمج تماما عن طريق الطرد المركزي لهم في 46 غرام لمدة دقيقتين. بعناية إزالة supernatent تماما وإضافة حل MANG إلى بيليه protoplast لتحقيق خمس مرات عشرة إلى ستة لكل ملليلتر. استخدام ماصة لإضافة 10 ميكروغرام من الحمض النووي البلازما و 300 ميكرولترات من محلول بروبلاست إلى أنبوب جديد 13 ملليلتر جولة القاع.
مزيج عن طريق تناوب بلطف الأنابيب باليد ثم تضاف على الفور 300 ميكرولترس من الطازجة أعدت 40٪ PEG الحل. تخلط تماما عن طريق إمالة الأنبوب أفقيا تقريبا وتناوب عليه لطيف عدة مرات باليد. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
ثم تضاف ملليلتر واحد من حل W5 ومزيج تماما عن طريق تناوب بلطف الأنبوب باليد كما كان سابقا. احتضان العينة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر مرتين مع إضافة أول 1.5 ملليلتر ثم مليلترين من W5 وبعد الجمع النهائي والاختلاط، احتضان لمدة 30 دقيقة.
الطرد المركزي الأنبوب في 46 gs لمدة أربع دقائق ومن ثم التخلص من الفائق. إضافة ملليلترين من حل W5 إلى بيليه ومزيج بلطف، ولكن تماما، بنفس الطريقة كما كان سابقا. احتضان في 22 درجة مئوية في غرفة مظلمة لمدة 18 ساعة.
لتحليل استيراد البروتين باستخدام المجهر فلوريسكنس، استخدم ماصة مع طرف مشذب لوضع 10 ميكرولترات من محلول الوُرُب على شريحة زجاجية. استخدم زلة غطاء لتغطية الحل بعناية لتجنب إتلاف الوُرُب البروتبلاست. ضع الشريحة على خشبة مسرح المجهر الفلوري مع مرشح القبول الإثارة التي تم تعيينها لمراقبة البروتين الفلورسنت الأخضر و chlorophyll autofluorescence.
استخدام جهاز زوجين تهمة تبريد الكاميرا لالتقاط الصور ومعالجتها باستخدام برنامج تحرير تخيل لإنتاج الصور الملونة الزائفة. لاستخراج البروتين الكلي والتنقية المناعية، وإزالة ملليلتر واحد من محلول بروبلاست وخلط المليلتر واحد المتبقية. نقل هذا الحل بروبلاست إلى أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي في 46 gs لمدة أربع دقائق.
إزالة فائقة بعد الانتهاء من الطرد المركزي وإضافة 80 ميكرولترات من عازلة denaturation. دوامة بقوة لمدة خمس ثوان. إضافة خمسة XDS عينة العازلة، مزيج جيدا ويغلي لمدة 10 دقائق لdenature.
تابع صفحة STS القياسية والتنقية المناعية مع الأجسام المضادة لـ GFP. RbcS وTGFT، وهو بناء الانصهار ترميز 79 بقايا الأحماض الأمينية الطرفية من RBCS التي تحتوي على ببتيد العبور تنصهر في GFP، واستخدمت لدراسة استيراد البروتينات إلى البلاستكات الكلورية عن طريق المجهر فلوريسكنس ومناعة. عند فحصها بواسطة المجهر فلوريسنس، إشارات الفلورسنت الخضراء من البروتين المستهدف دمجها مع إشارات الفلورسنت الحمراء من فلورورس الكلورو تشير إلى استيراد البروتين إلى البلاستيدات الكلورية.
بعد عزل البروتين الكلي ، لوحظ اثنين من نطاقات البروتين في مناعية ، وتبين أن البروتين تم استيرادها بشكل صحيح في الكلوروبلاست. ويتوافق النطاق العلوي مع السلائف الطول الكامل والفرقة السفلية إلى النموذج المجهز بعد الاستيراد إلى chloroplasts. زادت كمية الشكل المجهز للبروتين بطريقة تعتمد على الوقت ، مما يشير إلى أن البروتين يتم استيراده إلى الكلوروبلاست.
في هذا التطور، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلايا لاستكشاف البروتين متعبة أو خيط غشاء قطف في Arabidopsis.
