Cette méthode de gain de temps réduit la variabilité entre les cycles de procédures immunohistochimiques dans les études en neurosciences afin d’optimiser la visualisation de l’anatomie et des protéines et tissus locaux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle réduit le temps nécessaire à la cryosection et à la monture des tissus cérébraux en combinant plusieurs cerveaux en un seul bloc gelé. Bien que cette technique soit optimisée pour les sections coronaires du cerveau des rongeurs, elle peut être adaptée aux sections sagittales ou transversales ou à différents types de tissus tels que le muscle ou le foie.
Après perfusion transcardique réussie, post-fixer le cerveau des animaux dans un flacon de 25 millilitres de 4% paraformaldéhyde dans PBS pendant 24 heures. Après cela, utilisez des forceps à pointes émoussées pour enlever le cerveau du paraformaldéhyde. Transférez le cerveau dans un flacon avec environ 20 millilitres de solution de saccharose à 30 % dans le SCT.
Gardez le cerveau et la solution jusqu’à ce qu’ils descendent au fond du flacon. Ensuite, placez un bécher en verre de 500 millilitres sur un lit de glace sèche dans un seau à glace. Verser ensuite 300 à 400 millilitres d’isopentane dans le bécher.
Maintenir l’isopentane entre 45 et 50 degrés Celsius négatifs. Sur le dessus du banc, remplir un moule d’intégration jetable à mi-chemin plein avec la température de coupe optimale ou composé OCT. Utilisez une aiguille pour enlever les bulles d’air du moule.
Utilisez les forceps à pointe émoussée pour enlever le premier cerveau de la solution de saccharose. Ensuite, utilisez une nouvelle lame de rasoir pour enlever le cervelet et les ampoules olfactives avant de séparer les hémisphères. Ensuite, donnez au cerveau un système de dénomination numérique.
Utilisez des forceps contondants, ramasser le cerveau pour être placé en position deux, et l’orienter avec le côté à couper d’abord face vers le haut. Abaissez le cerveau dans l’OCT et utilisez la pince à épiler pour ajuster sa position jusqu’à ce qu’il reste indépendant. Une modification clé de cette technique est l’espace vide dans la position un.
Cet espace est désigné pour permettre une identification facile de l’orientation mégabraïne et donc identifier l’animal associé à chaque cerveau. Après que tous les cerveaux ont été placés dans le moule, ajouter suffisamment d’OCT pour couvrir le sommet du cerveau, puis utiliser une aiguille pour enlever les bulles d’air. Tenez le coin du moule avec des forceps assurant que les forceps ne deviennent pas partiellement submergés dans l’OCT.
Ensuite, abaissez le moule dans l’isopentane de sorte que le tiers inférieur du moule est submergé. Après 30 secondes, abaisser le moule entier dans l’isopentane et le libérer des forceps. Après trois minutes, utiliser les forceps pour enlever le moule de l’isopentane.
Enveloppez immédiatement le moule et son contenu dans du papier d’aluminium et étiquetez-le de façon appropriée. Transférer la mégabrane dans un congélateur négatif de 20 degrés Celsius pendant au moins 24 heures. Tout d’abord, réglez la température de l’armoire cryostat à 19 degrés Celsius négatifs.
Retirer la mégabrane du congélateur et la placer dans le cryostat. Placez ensuite un mandrin et deux pinceaux à pointe mince dans le cryostat. Après cela, étiquetez les diapositives avec le numéro d’identification des mégabrassures et le numéro de diapositives et mentent les glissières sur le chauffe-glissière.
Ensuite, déballer le mégabrain et utiliser une lame de rasoir pour couper les coins du moule. Distribuez une fine couche d’OCT sur le mandrin. Placez rapidement le mégabrain sur le mandrin.
Après que l’OCT est complètement gelé, appliquez une couche de deux millimètres d’OCT autour des côtés de la mégabrane et laissez-le courir sur les côtés sur le mandrin. Utilisez une lame de rasoir pour enlever tout excès d’OCT sur les côtés et le bas du mandrin. Tout d’abord, placez le mandrin monté avec le mégabrain sur la tête de mandrin du cryostat.
Réglez ensuite le cryostat à l’épaisseur désirée. Coupez l’OCT et les tissus au besoin pour atteindre la région du cerveau désirée pour la collecte des tissus. Ensuite, abaissez la plaque anti-roulis jusqu’à ce qu’elle repose sur la scène et tournez la poignée cryostat pour prendre une seule section.
Soulevez lentement la plaque anti-roulis, en prenant soin que la section tissulaire n’est pas touchée. Utilisez doucement les pinceaux pour dérouler la section tissulaire jusqu’à ce qu’elle soit couchée à plat. Si nécessaire, maintenez l’OCT à plat à l’aide des pinceaux pour éviter de rouler.
Retirez ensuite la glissière du chauffe-glissière et faites planer le côté de l’étiquette de la glissière vers le bas au-dessus de la section mégabraïne et laissez-la coller à la glissière. Appliquez rapidement une goutte de PBS sur la section tissulaire. À l’aide d’un pinceau à pointe fine plongé dans PBS, brossez toutes les bulles dans la section tissulaire et dépliez le tissu de sorte qu’il est couché à plat sur la lame.
Enfin, placez la lame sur le chauffe-glissière pour sécher pendant 45 minutes et rangez la glissade à 80 degrés Celsius négatifs. Dans ce protocole, le tissu cérébral de neuf animaux ont été préparés et cryosectionnés simultanément. Après la cryosection, la coloration H&E peut être effectuée pour évaluer la qualité de cryoprotection.
Les résultats représentatifs de la molécule ionisée d’adaptateur de fixation de calcium un ou Iba1 soudant des microglies montrent la coloration cohérente entre chaque cerveau d’étude sur un mégabrain simple. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de surveiller constamment la température tout en gelant la mégabraïne pour empêcher la fissuration ou la décongélation, puis le regel du tissu qui conduit à l’intégrité anormale des tissus. Il n’est pas conseillé de séparer différents groupes de traitement dans des mégabrassés distincts, car cela peut créer une variance entre les groupes pendant la coloration et réduire les biais et la subjectivité pendant l’imagerie et l’analyse.
N’oubliez pas que le travail avec le paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux et des précautions telles que le port du PBE et le travail dans une hotte doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
