El polifosfato inorgánico es un elemento clave en la respuesta al estrés bacteriano. Pero los métodos más antiguos para extraer y medir el pólipo en bacterias son complejos e intensivos en mano de obra. La principal ventaja de esta técnica es que permite una cuantificación rápida, sensible y económica de los niveles de pólipo en una variedad de diferentes especies bacterianas.
El procedimiento será demostrado por Arya Pokhrel, una estudiante de pregrado de mi laboratorio. Para empezar, crecer lactobacillus reuteri bacterias en el medio de inducción de enzimas málicas sin cistina a 37 grados celsius durante la noche sin agitar. Centrifugar un mililitro de este cultivo nocturno en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para cosechar suficientes células para producir un total de 50 a 100 microgramos de proteína celular.
Retire el sobrenadante del pellet celular por completo, y luego agregue 250 microlitros de ni búfer de lísis GITC y resuspend por vórtice. Incubar a 95 grados centígrados durante 10 minutos para anlicer las células. Almacene ellysate a 80 grados centígrados.
En primer lugar, prepare los estándares de BSA que contengan cero, 1, 2 y 4 miligramos por mililitro de BSA en el búfer de lelisis GITC. Aliquot cinco microlitros de licadadas de células bien mezcladas y cinco microlitros de estándares BSA para separar pozos en una placa clara de 96 pozos. Agregue 195 microlitros de reactivo Bradford a cada pozo y mida la absorbancia a 595 nanómetros en un lector de placas.
Calcular la cantidad de proteína en cada pozo en comparación con la curva estándar de BSA como se describe en el manuscrito. Para determinar la cantidad total de proteína en cada muestra, multiplique el valor resultante por 05. Para iniciar la extracción de polifosfato, agregue 250 microlitros de 95% de etanol a cada muestra de lesed GITC, y vórtice para mezclar.
Pipetear esta mezcla a una columna de espín de membrana de sílice colocada en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Centrifugar a 16, 100 g durante 30 segundos. Deseche el flujo y agregue 750 microlitros de la mezcla de trishidloruro, cloruro de sodio, EDTA y etanol.
Centrifugar a 16, 100 gs durante 30 segundos. Deseche el flujo a través y centrifugar la columna de giro a 16, 100 gs durante dos minutos. Coloque la columna en un tubo de microfugo limpio de 1,5 mililitros.
Añadir 150 microlitros de 50 mililitros de pH ocho trishidloruro, e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Elute polyP por centrifugar a 8.000 g durante dos minutos. Comience por preparar normas que contengan cero, cinco, 50 o 200 fosfato de potasio micromolar en 50 pH mililalos ocho trishidloruro.
Aliquot 100 microlitros de cada estándar de fosfato y 100 microlitros de muestras de poliP extraídos en pozos separados de una placa de 96 pozos transparente. Preparar una mezcla maestra que contenga, por muestra, 30 microlitros de tampón de reacción 5X ScPPX, 19 microlitros de agua y un microlitro de ScPPX purificado.
E incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados. El día de la detección, prepare un nuevo stock de trabajo de solución de detección mezclando a 9,12 mililitros de base de solución de detección con 88 mililitros de un ácido ascórbico molar, y permita que llegue a temperatura ambiente antes de su uso. Agregue 50 microlitros de solución de detección a cada muestra y estándares en la placa de 96 pozos.
Para permitir el desarrollo del color, incubar la placa a temperatura ambiente durante aproximadamente dos minutos. Utilice un lector de placas para medir la absorbancia a 882 nanómetros y calcular la concentración de fosfato de cada muestra en comparación con la curva estándar de fosfato de potasio. A continuación, convierta las concentraciones de fosfato en nanomoles de fosfato derivado de poliP en cada litorilla celular y normalice el contenido de pólipo celular en proteína celular total, como se describe en el manuscrito.
E.coli de tipo salvaje, una bacteria gramnegativa, cultivada en LB no produjo pólipos. Pero cuando se cultiva en MOPS, produjo alrededor de 192 nanomoles poliP por miligramo de proteína total. Un mutante de E.coli delta ppk, que carece de polip quinasa, no produjo ningún pólipo en ninguno de los medios.
Un mutante de ppx delta, que carece de exopolifosfatasa, produjo aproximadamente la misma cantidad de pólipo que el tipo salvaje. Y el mutante delta phoB, que es defectuoso en el transporte de fosfato, produjo significativamente menos pólipo que el tipo salvaje. L.reuteri de tipo salvaje, una bacteria grampositiva cultivada durante la noche en medio MEIC acumulada alrededor de 51 nanomoles poliP por miligramo de proteína total.
Un mutante nulo L.reuteri ppk1 que carecía de quinasa polip contenía menos de la mitad de esta cantidad. Esta presencia de pólipo en el mutante nulo ppk1 se debe probablemente a L.reuteri que contiene una segunda polip quinasa. Mycobacterium smegmatis cepa SMR cinco, cultivada en el medio Hartmans-de Bont en ausencia de etanol acumulado alrededor de 141 nanomoles poliP por miligramo de proteína total.
Mientras que el tratamiento con etanol dio lugar a un aumento triple. Después de este procedimiento, se puede realizar electroforesis de gel de acrilamida para evaluar las diferencias en la longitud de la cadena poliP. Al intentar este procedimiento, evite errores comunes.
Recuerde evitar que las burbujas en los pozos de placas de microtíteres, y tenga cuidado de transferir sus muestras al tubo apropiado al cambiar de la columna al tubo de microfugo. No olvide que trabajar con GITC y ácidos fuertes puede ser peligroso, y siempre se debe usar el equipo de protección adecuado durante la realización de este procedimiento.
