Неорганический полифосфат является ключевым элементом бактериальной реакции стресса. Но старые методы извлечения и измерения полипа в бактериях являются сложными и трудоемкими. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет быстро, чувствительно и недорого количественно оценить уровни полипа у различных видов бактерий.
Процедуру продемонстрирует Арья Похрел, студентка моей лаборатории. Для начала выращивайте бактерии лактобактерий reuteri в среде индукции малого фермента без цистина при 37 градусах по Цельсию на ночь без тряски. Центрифуга один миллилитр этой ночной культуры в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки для сбора достаточного количества клеток, чтобы дать в общей сложности от 50 до 100 микрограмм клеточного белка.
Удалите супернатант из клеточной гранулы полностью, а затем добавьте 250 микролитров буфера лиза GITC и повторное добавление вихрем. Инкубировать при 95 градусах по Цельсию в течение 10 минут, чтобы подонизить клетки. Храните лисат при 80 градусах по Цельсию.
Во-первых, подготовь стандарты BSA, содержащие ноль, 1, 2 и 4 миллиграмма на миллилитр BSA в буфере лиза ГИТК. Aliquot пять микролитров талых, хорошо смешанных клеток лизатов и пять микролитров стандартов BSA для отдельных скважин в ясной пластине 96 скважин. Добавьте 195 микролитров реагента Брэдфорда к каждой пластине и измерьте абсорбанс на 595 нанометров в считыватель пластин.
Рассчитайте количество белка в каждой колодец по сравнению со стандартной кривой BSA, изложенной в рукописи. Чтобы определить общее количество белка в каждом образце, умножьте полученное значение на 05. Чтобы начать экстракции полифосфата, добавить 250 микролитров 95% этанола в каждом ГИТК лизированную образец, и вихрь смешивать.
Pipette эту смесь кремнезема мембраны спина колонке помещены в 1,5 миллилитров центрифуги трубки. Центрифуга при 16, 100 г в течение 30 секунд. Отбросьте поток и добавьте 750 микролитров трис-гидрохлорида, хлорида натрия, ЭДТА и этаноловой смеси.
Центрифуга при 16, 100 г в течение 30 секунд. Отбросьте поток через и центрифуга спина колонки на 16, 100 г в течение двух минут. Поместите столбец в чистую 1,5 миллилитровую трубку микрофуза.
Добавьте 150 микролитров 50 миллимолярный рН восемь трис-гидрохлорид, и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Elute polyP путем центрифугирования на 8000 г в течение двух минут. Начните с подготовки стандартов, содержащих нулевой, пять, 50 или 200 микромолейных фосфатов калия в 50 миллимолярн рН восемь трис-гидрохлорид.
Aliquot 100 микролитров каждого стандарта фосфатов и 100 микролитров извлеченных образцов полиП в отдельные скважины ясной пластины 96 скважин. Подготовь мастер-микс, содержащий, на выборку, 30 микролитров буфера реакции 5X ScPPX, 19 микролитров воды и один микролитер очищенного ScPPX. Добавьте 50 микролитров мастер-микса к каждой колодец из 96 пластин.
И инкубировать в течение 15 минут при 37 градусах по Цельсию. В день обнаружения подготовьте свежий рабочий запас раствора обнаружения путем смешивания на 9,12 миллилитров базы раствора обнаружения с 88 миллилитров одной молярной аскорбиновой кислоты, и дайте ему прийти к комнатной температуре перед использованием. Добавьте 50 микролитров раствора обнаружения к каждому образцу и стандартам в пластине 96 хорошо.
Чтобы обеспечить развитие цвета, инкубировать пластину при комнатной температуре в течение примерно двух минут. Используйте считыватель пластин для измерения абсорбция на 882 нанометров и расчета концентрации фосфатов в каждом образце по сравнению со стандартной кривой фосфата калия. Затем преобразовать концентрации фосфатов в наномолы полипа, полученных фосфатов в каждой клетке лисата и нормализовать содержание клеточного полипа в общей клеточного белка, как описано в рукописи.
Дикий тип E.coli, грамотрицательных бактерий, выращенных в LB производится не полип. Но при выращении в MOPS, производится около 192 наномол полип на миллиграмм общего белка. Мутант E.coli дельта ppk, который не имеет polyP киназы, не производится полип в любой среде.
Дельта ppx мутант, который не хватает exopolyphosphatase, производится примерно такое же количество полипа, как дикий тип. А дельта-фосфат,дефектный в транспортировке фосфатов, произвел значительно меньше полипа, чем дикий тип. Дикий тип L.reuteri, грамположительных бактерий, выращенных в одночасье в среде MEIC накопленных около 51 наномолы полип на миллиграмм общего белка.
L.reuteri ppk1 нулевой мутант не хватает полиП киназы содержится менее половины этой суммы. Это наличие полипа в ppk1 нулевой мутант, вероятно, из-за L.reuteri содержащие второй полиП киназы. Mycobacterium smegmatis штамм SMR 5, выращенный в среде Хартманс-де-Бонт при отсутствии этанола, накопленного около 141 наномоле на миллиграмм общего белка.
В то время как обработка этанола привела к три раза больше. После этой процедуры, акриламид гель электрофорез может быть выполнен для оценки различий в длине цепи полиП. При попытке этой процедуры, избежать распространенных ошибок.
Помните, чтобы избежать получения пузырьков в колодцах пластины микротитр, и будьте осторожны, чтобы передать ваши образцы в соответствующую трубку при переходе от колонки к микрофуге трубки. Не забывайте, что работа с ГИТК и сильными кислотами может быть опасной, и правильное защитное оборудование всегда следует носить при выполнении этой процедуры.
