Le polyphosphate inorganique est un élément clé de la réponse au stress bactérien. Mais les méthodes plus anciennes pour extraire et mesurer le polyP chez les bactéries sont complexes et à forte intensité de main-d’œuvre. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une quantification rapide, sensible et peu coûteuse des niveaux de polyP chez une variété d’espèces bactériennes différentes.
La procédure sera démontrée par Arya Pokhrel, une étudiante de premier cycle de mon laboratoire. Pour commencer, cultiver des bactéries lactobacillus reuteri dans le milieu d’induction enzymatique malique sans cystine à 37 degrés Celsius pendant la nuit sans trembler. Centrifugeuse d’un millilitre de cette culture nocturne dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre pour récolter suffisamment de cellules pour produire un total de 50 à 100 microgrammes de protéines cellulaires.
Retirez complètement le supernatant de la pastille cellulaire, puis ajoutez 250 microlitres gitc lysis tampon et résuspendez par vortex. Incuber à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes pour lyse les cellules. Conserver le lysate à 80 degrés Celsius.
Tout d’abord, préparez des normes BSA contenant zéro, 1, 2 et 4 milligrammes par millilitre de BSA dans le tampon de lyse GITC. Aliquot cinq microlitres de lysates cellulaires décongelés et bien mélangés et cinq microlitres des normes BSA pour séparer les puits dans une plaque de puits claire de 96. Ajouter 195 microlitres de réaccent de Bradford à chaque puits et mesurer l’absorption à 595 nanomètres dans un lecteur de plaques.
Calculez la quantité de protéines dans chaque puits par rapport à la courbe standard BSA telle qu’elle est décrite dans le manuscrit. Pour déterminer la quantité totale de protéines dans chaque échantillon, multipliez la valeur résultante par 05. Pour commencer l’extraction du polyphosphate, ajouter 250 microlitres de 95 % d’éthanol à chaque échantillon lysé gitc, et vortex à mélanger.
Pipette ce mélange à une colonne de spin de la membrane de silice placée dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Centrifugeuse à 16,100 g pendant 30 secondes. Jetez le débit et ajoutez 750 microlitres du mélange tris-hydrochlorure, chlorure de sodium, EDTA et éthanol.
Centrifugeuse à 16,100 gs pendant 30 secondes. Jeter le flux à travers et centrifuger la colonne de spin à 16, 100 gs pendant deux minutes. Placez la colonne dans un tube de microfuge propre de 1,5 millilitre.
Ajouter 150 microlitres de 50 millimilliards de pH huit trichlorure, et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Elute polyP en centrifugant à 8000 g pendant deux minutes. Commencez par préparer des normes contenant zéro, cinq, 50 ou 200 micromolaires de phosphate de potassium dans 50 millimolar pH huit trichlorure.
Aliquot 100 microlitres de chaque norme de phosphate et 100 microlitres d’échantillons de polyP extraits dans des puits séparés d’une plaque de puits claire de 96 puits. Préparer un mélange principal contenant, par échantillon, 30 microlitres de tampon de réaction ScPPX 5X, 19 microlitres d’eau et un microlitre de ScPPX purifié. Ajouter 50 microlitres du mélange principal à chaque puits de la plaque de puits 96.
Et incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Le jour de la détection, préparez un nouveau stock de travail de solution de détection en mélangeant à 9,12 millilitres de base de solution de détection avec 88 millilitres d’un acide ascorbique molaire, et laissez-le venir à la température ambiante avant utilisation. Ajouter 50 microlitres de solution de détection à chaque échantillon et aux normes de la plaque de puits 96.
Pour permettre le développement des couleurs, incuber la plaque à température ambiante pendant environ deux minutes. Utilisez un lecteur de plaques pour mesurer l’absorption à 882 nanomètres et calculer la concentration de phosphate de chaque échantillon par rapport à la courbe standard de phosphate de potassium. Convertissez ensuite les concentrations de phosphate en nanomoles de phosphate dérivé du polyP dans chaque lysate cellulaire et normalisez la teneur en polyP cellulaire en protéine cellulaire totale, comme décrit dans le manuscrit.
E.coli de type sauvage, une bactérie gramnégative, cultivée en LB, n’a produit aucun polyP. Mais lorsqu’il est cultivé en MOPS, produit environ 192 nanomoles polyP par milligramme de protéines totales. Un mutant ppk delta e.coli, qui manque de kinase polyP, n’a produit aucun polyP dans l’un ou l’autre médium.
Un mutant delta ppx, qui manque d’exopolyphosphatase, a produit à peu près la même quantité de polyP que le type sauvage. Et le mutant delta phoB, défectueux dans le transport du phosphate, a produit beaucoup moins de polyP que le type sauvage. L.reuteri de type sauvage, une bactérie gram-positive cultivée du jour au lendemain dans le milieu meic accumulé environ 51 nanomoles polyP par milligramme de protéines totales.
Un mutant null L.reuteri ppk1 dépourvu de kinase polyP contenait moins de la moitié de cette quantité. Cette présence de polyP dans le mutant nul ppk1 est probablement due à L.reuteri contenant une deuxième kinase polyP. Mycobacterium smegmatis souche SMR cinq, cultivé dans hartmans-de Bont moyen en l’absence d’éthanol accumulé environ 141 nanomoles polyP par milligramme de protéines totales.
Alors que le traitement à l’éthanol a entraîné une triple augmentation. Après cette procédure, l’électrophoresis de gel d’acrylamide peut être exécuté pour évaluer des différences dans la longueur de chaîne de polyP. Tout en essayant cette procédure, éviter les erreurs courantes.
N’oubliez pas d’éviter d’avoir des bulles dans les puits de plaques de microtiter, et veillez à transférer vos échantillons dans le tube approprié lors du passage de la colonne au tube de microfuge. N’oubliez pas que travailler avec gitc et acides forts peut être dangereux, et l’équipement de protection approprié doit toujours être porté tout en exécutant cette procédure.
