İnorganik polifosfat bakteriyel stres yanıtında önemli bir elementtir. Ancak bakterilerde poliP ayıklama ve ölçme için eski yöntemler karmaşık ve emek yoğun. Bu tekniğin en büyük avantajı, farklı bakteri türlerinin çeşitli poliP düzeylerinin hızlı, hassas ve ucuz nicel sağlar.
Prosedür arya Pokhrel, benim laboratuvar bir lisans öğrencisi tarafından gösterilecek. Başlamak için, sistin olmadan malik enzim indüksiyon orta lactobacillus reuteri bakterilerbüyümek 37 derece santis sallayarak olmadan bir gecede. 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde bu gece kültürünün bir mililitresini toplam 50 ila 100 mikrogram hücresel protein vermeye yetecek kadar hücre toplamak için santrifüj edin.
Hücre peletinden süpernatant'ı tamamen çıkarın ve sonra 250 mikrolitre GITC lysis tamponu ekleyin ve girdap ile askıya alın. Hücreleri 10 dakika boyunca 95 derecede kuluçkaya yatırın. Lysate'yi 80 derecede saklayın.
İlk olarak, GITC lysis tamponba mililitre başına sıfır, 1, 2 ve 4 miligram içeren BSA standartlarını hazırlamak. Aliquot beş mikrolitre çözülmüş, iyi karışık hücre lisates ve bsa standartlarına beş mikrolitre açık bir 96 kuyu plaka kuyuları ayırmak için. Her kuyuya 195 mikrolitre Bradford reaktifi ekleyin ve bir plaka okuyucuda 595 nanometrede emiciliği ölçün.
El yazmasında belirtildiği gibi BSA standart eğrisi ile karşılaştırıldığında her kuyudaki protein miktarını hesaplayın. Her örnekteki toplam protein miktarını belirlemek için, elde edilen değeri 05 ile çarpın. Polifosfat ekstraksiyonuna başlamak için, her GITC lysed numunesine 250 mikrolitre %95 etanol ekleyin ve girdap ları karıştırın.
Pipet bu karışımı bir silika membran spin sütuna yerleştirilir 1.5 mililitre santrifüj tüp. Santrifüj 16, 100 g 30 saniye. Akışı atın ve tris-hidroklorür, sodyum klorür, EDTA ve etanol karışımı 750 mikrolitre ekleyin.
Santrifüj 16, 100 gs 30 saniye. Akışı atın ve spin sütununa 16, 100 gs'de iki dakika santrifüj edin. Kolontemiz bir 1,5 mililitrelik mikrofuge tüp yerleştirin.
50 milimolar pH sekiz tris-hidroklorür 150 mikrolitre ekleyin ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka. Elute polyP santrifüj tarafından 8, 000 g iki dakika. 50 milimolar pH sekiz tris-hidroklorür sıfır, beş, 50 veya 200 mikromolar potasyum fosfat içeren standartları hazırlayarak başlayın.
Aliquot 100 mikrolitre her fosfat standart ve 100 mikrolitre çıkarılan poliP örnekleri net bir 96 kuyu plaka ayrı kuyular halinde. Örnek başına 30 mikrolitre 5X ScPPX reaksiyon tamponu, 19 mikrolitre su ve bir mikrolitre saflaştırılmış ScPPX içeren bir ana karışım hazırlayın.
Ve 37 derecede 15 dakika kuluçkaya yat. Tespit gününde, 9,12 mililitre algılama çözeltisi tabanını 88 mililitre bir azı miliskorbik asitle karıştırarak yeni bir çalışma stoğu hazırlayın ve kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. 96 kuyu plakasındaki her numuneye ve standartlara 50 mikrolitre algılama çözeltisi ekleyin.
Renk gelişimine izin vermek için, yaklaşık iki dakika oda sıcaklığında plaka kuluçka. 882 nanometrede emiciliği ölçmek ve potasyum fosfat standart eğrisi ile karşılaştırıldığında her numunenin fosfat konsantrasyonu hesaplamak için bir plaka okuyucu kullanın. Daha sonra fosfat konsantrasyonlarını her hücreli sıvıda poliP kaynaklı fosfatın nanomollerine dönüştürün ve hücresel poliP içeriğini el yazmasında açıklandığı gibi toplam hücresel proteine normalleştirin.
Yabani tip E.coli, bir gram-negatif bakteri, LB yetiştirilen hiçbir poliP üretti. Ama MOPS yetiştirilen, toplam protein miligram başına yaklaşık 192 nanomoles poliP üretti. PoliP kigazlarından yoksun bir E.coli delta ppk mutant, her iki ortamda da poliP üretmez.
Bir delta ppx mutant, hangi exopolyphosphatase yoksun, yabani tip olarak poliP yaklaşık aynı miktarda üretti. Ve fosfat taşımasında kusurlu olan delta phoB mutantı vahşi tipten çok daha az poliP üretti. Yabani tip L.reuteri, meic ortamda bir gecede yetiştirilen bir gram-pozitif bakteri toplam protein miligram başına yaklaşık 51 nanomolpoliP birikmiş.
PoliP kigazından yoksun bir L.reuteri ppk1 null mutant bu miktarın yarısından daha azını içeriyordu. Ppk1 null mutant poliP bu varlığı muhtemelen ikinci bir poliP kiazlık içeren L.reuteri kaynaklanmaktadır. Mycobacterium smegmatis suş SMR beş, Hartmans-de Bont orta etanol yokluğunda toplam protein miligram başına yaklaşık 141 nanomol poliP birikmiş büyüdü.
Etanol tedavisi üç kat artışile sonuçlanırken. Bu işlemden sonra, akrilamid jel elektroforez poliP zincir uzunluğu farklılıkları değerlendirmek için yapılabilir. Bu yordamı çalışırken, sık yapılan hatalardan kaçının.
Mikrotiter plaka kuyularında kabarcıklar almaktan kaçınmayı unutmayın ve kolondan mikrofuge tüpüne geçerken numunelerinizi uygun tüpe aktarmaya dikkat edin. GITC ve güçlü asitler le çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken uygun koruyucu ekipmanın her zaman giyilmesi gerektiğini unutmayın.
