Il polifosfato inorganico è un elemento chiave nella risposta allo stress batterico. Ma i metodi più vecchi per estrarre e misurare la poliP nei batteri sono complessi e ad alta intensità di lavoro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una quantificazione rapida, sensibile ed economica dei livelli di poliP in una varietà di diverse specie batteriche.
La procedura sarà dimostrata da Arya Pokhrel, studentessa universitaria del mio laboratorio. Per iniziare, far crescere i batteri lactobacillus reuteri nel mezzo di induzione enzimatico malico senza cistina a 37 gradi celsius durante la notte senza tremare. Centrifugare un millilitri di questa coltura notturna in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri per raccogliere abbastanza cellule da produrre un totale di 50-100 microgrammi di proteine cellulari.
Rimuovere completamente il supernatante dal pellet cellulare, quindi aggiungere 250 microlitri GITC lysis buffer e resuspend mediante vortice. Incubare a 95 gradi celsius per 10 minuti per liscire le cellule. Conservare il lysate a 80 gradi celsius.
In primo luogo, preparare gli standard BSA contenenti zero, 1, 2 e 4 milligrammi per millilitro di BSA nel buffer di lisi GITC. Aliquota cinque microlitri di lysati a celle scongelate e ben miscelati e cinque microlitri di standard BSA per separare i pozzi in una piastra chiara da 96 pozza. Aggiungere 195 microlitri di reagente di Bradford ad ogni pozzo e misurare l'assorbanza a 595 nanometri in un lettore di lastre.
Calcola la quantità di proteine in ogni pozzo rispetto alla curva standard BSA come delineato nel manoscritto. Per determinare la quantità totale di proteine in ogni campione, moltiplicare il valore risultante per 05. Per iniziare l'estrazione di polifosfati, aggiungere 250 microlitri di etanolo al 95% a ciascun campione di GITC e vortice da mescolare.
Pipettare questa miscela in una colonna di spin a membrana di silice posta in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. Centrifuga a 16.100 g per 30 secondi. Scartare il flusso attraverso e aggiungere 750 microlitri della miscela tris-cloridrato, cloruro di sodio, EDTA ed etanolo.
Centrifuga a 16.100 g per 30 secondi. Scartare il flusso attraverso e centrifugare la colonna di spin a 16, 100 g per due minuti. Posizionare la colonna in un tubo di microfugo pulito da 1,5 millilitri.
Aggiungere 150 microlitri di pH 50 millimolare otto triscloridrato e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Elute polyP centrifugando a 8.000 g per due minuti. Iniziare preparando standard contenenti zero, cinque, 50 o 200 fosfato di potassio micromolare in 50 pH millimolare otto triscloridrato.
Aliquota 100 microlitri di ogni norma fosfato e 100 microlitri di campioni di poliP estratti in pozzi separati di una piastra chiara da 96 pozza. Preparare una miscela master contenente, per campione, 30 microlitri di tampone di reazione ScPPX 5X, 19 microlitri d'acqua e un microlitri di ScPPX purificato. Aggiungere 50 microlitri del mix principale a ciascun pozzo della piastra del pozzo 96.
E incubare per 15 minuti a 37 gradi celsius. Il giorno del rilevamento, preparare un nuovo stock di soluzione di rilevamento mescolando a 9,12 millilitri di base della soluzione di rilevamento con 88 millilitri di un acido ascorbico molare e lasciare che venga a temperatura ambiente prima dell'uso. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di rilevamento a ciascun campione e standard nella piastra del pozzo 96.
Per consentire lo sviluppo del colore, incubare la piastra a temperatura ambiente per circa due minuti. Utilizzare un lettore di lastre per misurare l'assorbanza a 882 nanometri e calcolare la concentrazione fosfato di ciascun campione rispetto alla curva standard del fosfato di potassio. Quindi convertire le concentrazioni di fosfati in nanomoli di fosfato derivato dal poliP in ogni lisato cellulare e normalizzare il contenuto di poliP cellulare in proteine cellulari totali, come descritto nel manoscritto.
Il tipo selvatico E.coli, un batterio gram-negativo, coltivato in LB non produceva poliP. Ma se coltivato in MOPS, ha prodotto circa 192 nanomoli poliP per milligrammo di proteine totali. Un mutante delta ppk E.coli, privo di poliP chinasi, non produceva poliP in entrambi i mezzi.
Un mutante delta ppx, che manca di esopolifosfatasi, produceva approssimativamente la stessa quantità di poliP del tipo selvaggio. E il mutante delta phoB, difettoso nel trasporto dei fosfati, produceva molto meno poliP rispetto al tipo selvaggio. L.reuteri di tipo selvatico, un batterio gram-positivo coltivato durante la notte nel mezzo MEIC, ha accumulato circa 51 nanomoli poliP per milligrammo di proteine totali.
Un mutante nullo L.reuteri ppk1 privo di poliP chinasi conteneva meno della metà di questa quantità. Questa presenza di poliP nel mutante nullo ppk1 è probabilmente dovuta al fatto che L.reuteri contiene una seconda poliP chinasi. Mycobacterium smegmatis strain SMR five, coltivato nel mezzo Hartmans-de Bont in assenza di etanolo accumulato circa 141 nanomoli poliP per milligrammo di proteine totali.
Mentre il trattamento con etanolo ha comportato un triplice aumento. Seguendo questa procedura, l'elettroforesi del gel di acrilammide può essere eseguita per valutare le differenze nella lunghezza della catena poliP. Durante il tentativo di questa procedura, evitare errori comuni.
Ricordarsi di evitare di ottenere bolle nei pozzi della piastra del microtitoro e fare attenzione a trasferire i campioni nel tubo appropriato quando si passa dalla colonna al tubo di microfugo. Non dimenticare che lavorare con GITC e acidi forti può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero sempre essere indossati dispositivi di protezione adeguati.
