Anorganisches Polyphosphat ist ein Schlüsselelement bei der bakteriellen Stressreaktion. Aber ältere Methoden zur Extraktion und Messung von Polyp in Bakterien sind komplex und arbeitsintensiv. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine schnelle, empfindliche und kostengünstige Quantifizierung von Polyp-Spiegeln in einer Vielzahl von verschiedenen Bakterienarten ermöglicht.
Das Verfahren wird von Arya Pokhrel, einer Studentin aus meinem Labor, demonstriert. Zu Beginn, wachsen Lactobacillus Reuteri Bakterien in malischen Enzym Induktionmedium ohne Cystin bei 37 Grad Celsius über Nacht ohne schütteln. Zentrifugieren Sie einen Milliliter dieser Nachtkultur in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr, um genügend Zellen zu ernten, um insgesamt 50 bis 100 Mikrogramm zelluläres Protein zu erhalten.
Entfernen Sie den Überstand vollständig aus dem Zellpellet, und fügen Sie dann 250 Mikroliter GITC Lyse Puffer und resuspendieren durch Wirbel. Bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren, um die Zellen zu lysieren. Bewahren Sie das Lysat bei 80 Grad Celsius auf.
Erstellen Sie zunächst BSA-Standards mit Null, 1, 2 und 4 Milligramm pro Milliliter BSA im GITC-Lysepuffer. Aliquot fünf Mikroliter aufgetaut, gut gemischte Zelllysate und fünf Mikroliter BSA-Standards, um Brunnen in einer klaren 96-Well-Platte zu trennen. Fügen Sie 195 Mikroliter Bradford-Reagenz zu jedem Brunnen hinzu und messen Sie die Absorption bei 595 Nanometern in einem Plattenleser.
Berechnen Sie die Proteinmenge in jedem Brunnen im Vergleich zur BSA-Standardkurve, wie im Manuskript beschrieben. Um die Gesamtmenge des Proteins in jeder Probe zu bestimmen, multiplizieren Sie den resultierenden Wert mit 05. Um die Polyphosphatextraktion zu starten, fügen Sie 250 Mikroliter 95% Ethanol in jede GITC-Lysed-Probe und Wirbel zum Mischen hinzu.
Pipette dieses Gemisch zu einer Kieselsäure-Membran-Spin-Säule in einem 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr platziert. Zentrifuge bei 16, 100 g für 30 Sekunden. Entsorgen Sie den Durchfluss und fügen Sie 750 Mikroliter trishydrochlorid, Natriumchlorid, EDTA und Ethanol-Gemisch hinzu.
Zentrifuge bei 16, 100 g für 30 Sekunden. Entsorgen Sie den Durchfluss und zentrieren Sie die Spinsäule zwei Minuten lang bei 16, 100 g. Legen Sie die Säule in ein sauberes 1,5 Milliliter Mikrofugerohr.
150 Mikroliter 50 Millimolar pH-Gehalt acht Tris-Hydrochlorid hinzufügen und bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubieren. Elute PolyP durch Zentrifugieren bei 8 000 g für zwei Minuten. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Standards, die Null, fünf, 50 oder 200 mikromolares Kaliumphosphat in 50 Millimolar pH-PH-Gehalt von acht Tris-Hydrochlorid enthalten.
Aliquot 100 Mikroliter jedes Phosphatstandards und 100 Mikroliter extrahierter PolyP-Proben in separaten Brunnen einer klaren 96-Well-Platte. Bereiten Sie eine Master-Mischung vor, die pro Probe 30 Mikroliter 5X ScPPX-Reaktionspuffer, 19 Mikroliter Wasser und einen Mikroliter gereinigten ScPPX enthält. Fügen Sie 50 Mikroliter der Master-Mischung zu jedem Brunnen der 96-Well-Platte hinzu.
Und 15 Minuten bei 37 Grad Celsius brüten. Am Tag der Detektion einen frischen Arbeitsbestand an Detektionslösung vorbereiten, indem Sie bei 9,12 Milliliter Detektionslösung Basis mit 88 Milliliter einer Molascorbinsäure mischen, und lassen Sie es auf Raumtemperatur vor Gebrauch kommen. Fügen Sie 50 Mikroliter Detektionslösung zu jeder Probe und Standards in der 96 Well Platte.
Um die Farbentwicklung zu ermöglichen, inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für etwa zwei Minuten. Verwenden Sie einen Plattenleser, um die Absorption bei 882 Nanometern zu messen und die Phosphatkonzentration jeder Probe im Vergleich zur Kaliumphosphat-Standardkurve zu berechnen. Konvertieren Sie dann die Phosphatkonzentrationen in Nanomole aus Polyp-abgeleitetem Phosphat in jeder Zelle lysiert und normalisieren den zellulären Polypgehalt in das gesamte zelluläre Protein, wie im Manuskript beschrieben.
Wildtyp E.coli, ein gramnegatives Bakterium, das in LB angebaut wird, produzierte kein PolyP. Aber wenn in MOPS angebaut, produziert etwa 192 Nanomole PolyP pro Milligramm des gesamten Proteins. Ein E.coli Delta ppk Mutant, dem PolyP-Kinase fehlt, produzierte kein PolyP in beiden Medien.
Ein Delta-Ppx-Mutant, dem es an Exopolyphosphatase fehlt, produzierte ungefähr die gleiche Menge an PolyP wie der Wildtyp. Und der Delta-PhoB-Mutant, der im Phosphattransport defekt ist, produzierte deutlich weniger Polyp als der Wildtyp. Wildtyp L.reuteri, ein grampositives Bakterium, das über Nacht im MEIC-Medium angebaut wird, akkumulierte etwa 51 NanomolpolyP pro Milligramm Gesamtprotein.
Ein L.reuteri ppk1 null Mutant ohne PolyP-Kinase enthielt weniger als die Hälfte dieser Menge. Dieses Vorhandensein von PolyP in der ppk1 null Mutant ist wahrscheinlich auf L.reuteri mit einer zweiten PolyP-Kinase zurückzuführen. Mycobacterium smegmatis Stamm SMR 5, in Hartmans-de Bont Medium in Abwesenheit von Ethanol angesammelt etwa 141 Nanomole PolyP pro Milligramm des Gesamten Proteins.
Während die Ethanolbehandlung zu einer Verdreifachung führte. Nach diesem Verfahren kann Acrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt werden, um Unterschiede in der Polyp-Kettenlänge zu bewerten. Vermeiden Sie beim Versuch dieses Verfahrens häufige Fehler.
Denken Sie daran, Blasen in Mikrotiter-Plattenbrunnen zu vermeiden, und achten Sie darauf, Ihre Proben auf das entsprechende Rohr zu übertragen, wenn Sie von der Säule zum Mikrofugerohr wechseln. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit GITC und starken Säuren gefährlich sein kann, und die richtige Schutzausrüstung sollte immer während der Durchführung dieses Verfahrens getragen werden.
