Dieses Protokoll ermöglicht es einem Forscher, mutierte Seeanemonen während der frühen Embryogenese zu identifizieren, so dass der phänotype postembryonale Entwicklung analysiert werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie verwendet werden kann, um einzelne Seeanemonen früh in der Ontogenie zu georten, ohne das Leben des Tieres zu opfern. Die Demonstration dieses Verfahrens wird Miguel Silva sein, ein Student aus meinem Labor.
Am Tag vor der Laichinduktion die Anemone nematostella vectensis in einen temperatur- und lichtgesteuerten Inkubator geben und den Inkubator so programmieren, dass die Tiere acht Stunden Licht bei 25 Grad Celsius ausgesetzt sind. Entfernen Sie am nächsten Tag die Tiere aus dem Brutkasten und lassen Sie sie bei Raumtemperatur auf einer Bankplatte, wenn das Licht eingeschaltet ist, um das Laichen zu ermöglichen, das innerhalb der folgenden eineinhalb bis zwei Stunden auftreten wird. Verwenden Sie eine Transferpipette, deren Spitze geschnitten wird, um die Öffnung zu vergrößern, um Eipakete aus dem weiblichen Behälter in einen spermahaltigen männlichen Behälter zu legen und sie für mindestens 15 Minuten im männlichen Behälter zu lassen, um eine Befruchtung zu ermöglichen.
Nach der Befruchtung, um die Ei-Pakete zu entjelly, legen Sie sie in Meerwasser mit 3%Cystein auf einem Glas Petrischale und sanft auf einem Shaker für 12 Minuten rühren. Dann brechen Klumpen mit einer Plastikpipette und weiter für weitere zwei bis drei Minuten zu agitieren, bis vollständig dejellied. Bewahren Sie die befruchteten Eier auf der gleichen Schale bei 16 Grad Celsius oder bei Raumtemperatur auf.
Am nächsten Tag bereiten Sie DEN DNA-Extraktionspuffer wie im Manuskript beschrieben vor, mischen Sie sie gut durch Wirbel nieren und aliquotieren Sie sie in PCR-Röhren, indem Sie 20 Mikroliter zu jeder Röhre hinzufügen. 1%Agarose im Meerwasser auflösen, in eine Petrischale gießen, um den Boden zu bedecken, und auf einer Bankplatte abkühlen, um ein Gelbett zu machen. Bedecken Sie das Gelbett mit frischem Meerwasser.
24-Stunden-Embryonen nach der Befruchtung mit einer Pipette in die agarosegelbetthaltige Petrischale übertragen. Legen Sie eine Wolframnadel in einen Bedarfshalter und sterilisieren, indem Sie ihre Spitze in Alkohol tauchen und setzen Sie es in Flammen, um den Alkohol zu verbrennen. Unter einem Sezieren Mikroskop, machen Eine Depression auf der Agarose, indem Sie die Wolframnadel verwenden, um ein Stück Oberflächen-Agarose über die Größe eines zu manipulierenden Embryos zu entfernen.
Dann, mit der Wolfram-Nadel, legen Sie den Embryo in die Depression mit seiner seitlichen Seite nach unten, um die Bewegung des Embryos für die Mikrochirurgie zu beschränken. Um eine erfolgreiche Operation durchzuführen, ist es wichtig, die Bewegung des Embryos zu beschränken. Mit der Wolframnadel, chirurgische entfernen Sie ein Stück Aboralgewebe entlang der oralen Aboralachse, gegenüber der oralen blastoporalen Öffnung.
Mit einer P20-Pipette das isolierte Abbruchgewebe in eine PCR-Röhre mit 20 Mikroliter DNA-Extraktionspuffer übertragen. Übertragen Sie den embryonalen Embryo nach der Operation in einen Brunnen einer 24-Well-Platte, die mindestens 500 Mikroliter frisches Meerwasser enthält. Und legen Sie die Platte mit post-chirurgischen Embryonen in einem Inkubator bei 16 Grad Celsius, bis die Genotypisierung abgeschlossen ist.
Um genomische DNA aus einzelnen Embryonen zu extrahieren, drehen Sie zunächst die PCR-Röhren, die den DNA-Extraktionspuffer und isolierte embryonale Gewebe enthalten, mit einer Minizentrifuge kurz herunter. Dann inkubieren Sie die Rohre bei 55 Grad Celsius für drei Stunden, während Wirbel für 30 Sekunden alle 30 Minuten, um das Aufbrechen von Zellklumpen zu gewährleisten und die Zelllyse zu verbessern. Nach der Inaktivierung der Proteinase K bei 95 Grad Celsius für vier Minuten, richten Sie eine PCR-Reaktion mit extrahierter genomischer DNA als Vorlage ein, um den Ort des Interesses zu verstärken.
Design gewünschte Primer, wie im Manuskript beschrieben. Richten Sie eine 20-Mikroliter-PCR-Reaktion ein. Führen Sie nach Abschluss der PCR eine Agarose-Gel-Elektrophorese durch, um die Größe und das Vorhandensein oder Fehlen von PCR-Produkten zu bestimmen, und stellen Sie sicher, dass der Zustand der Agarose-Gel-Elektrophorese in Abhängigkeit von der erwarteten Größe der PCR-Produkte angepasst wird.
Verwenden Sie PCR-Ergebnisse in Bezug auf Größe und Anwesenheit oder Abwesenheit oder PCR-Produkte, um jedem postoperativen Embryo einen Genotyp zuzuweisen und dann Embryonen nach ihrem Genotyp zu sortieren. Das Nematostella-Genom hat einen einzigen Ort, der ein Vorläuferprotein für das Neuropeptid GLWamid kodiert. Drei Knockout-Mutant-Allele am Ort des Ortes wurden bereits gemeldet.
PCR-Ergebnisse von zufällig beprobten Embryonen unter der Nachkommenschaft einer F1-Kreuzung zwischen einem heterozygoten Weibchen, das ein A-Knockout-Allel trägt, und heterozygoten Männchen, die ein C-Knockout-Allel tragen, zeigen verschiedene Genotypen. Embryonen eins und zwei zeigen ein einziges PCR-Band, das der erwarteten Größe von A Knockout Allel entspricht. Embryonen drei und sechs zeigen zwei PCR-Bänder mit den erwarteten Größen für die Knockout-Allele A und C.Embryos vier, sieben und acht zeigen ein einzelnes PCR-Band, das der erwarteten Größe des C-Knockout-Alleels entspricht.
Embryo 5 zeigt keine Bänder, was auf den Mangel an Primerbindung hindeutet. Um die Möglichkeit eines genomischen DNA-Extraktionsversagens auszuschließen, wurde eine andere PCR mit einem Reverse Primer ausgeführt, der an die Wildtypsequenz binden kann. Wenn ein PCR-Produkt von der erwarteten Größe nachgewiesen wurde, war die genomische DNA-Extraktion erfolgreich.
Während kein Produkt auf einen Fehler bei der Extraktion hindeutete. Obwohl dieses Protokoll für Seeanemonen-Embryonen konzipiert ist, ist es sicher möglich, diese Methode auf andere Cnidarians anzuwenden, wie Korallen und Quallen, wo genomische Informationen und Embryonen zugänglich sind. Nach diesem Verfahren werden die identifizierten Mutanten verwendet, um den Entwicklungsphänotyp zu bewerten.
Zum Beispiel können histologische Techniken wie Dieimmunostainierung verwendet werden, um Defekte in der Morphologie zu bewerten, während In-situ-Hybridisierung, quantitative RT-PCR in Echtzeit und RNA-seq zur Beurteilung von Defekten in der Genexpression verwendet werden können. Auch live Bildgebung kann verwendet werden, um Verhaltensmängel während der post-embryonalen Entwicklung zu bewerten, wie bei Larven oder in frühen Polypen.
