Questo protocollo consente a un ricercatore di identificare gli anemoni marini mutanti durante l'embriogenesi precoce in modo da poter analizzare il fenotipo dello sviluppo post-embrionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzato per genotipare singoli anemoni marini all'inizio dell'ontogenia senza sacrificare la vita dell'animale. A dimostrare questa procedura sarà Miguel Silva, uno studente laureato del mio laboratorio.
Il giorno prima dell'induzione della deposizione delle uova, posizionare l'anemone nematostella vectensis in un incubatore a temperatura e controllato dalla luce, programmando l'incubatore in modo che gli animali siano esposti a otto ore di luce a 25 gradi Celsius. Il giorno seguente, rimuovere gli animali dall'incubatrice e lasciarli su un piano di panca a temperatura ambiente con la luce alta per consentire la deposizione delle uova, che si verificherà entro le successive da una ora e mezza a due ore. Utilizzare una pipetta di trasferimento che viene tagliata per ingrandire l'apertura per posizionare i pacchetti di uova dal contenitore femminile in un contenitore maschile contenente spermatozoi e lasciarli nel contenitore maschile per almeno 15 minuti per consentire la fecondazione.
Dopo la fecondazione, per svalutare le confezioni di uova, metterle in acqua di mare contenente il 3%di cisteina su una piastra di Petri di vetro e agitare delicatamente su uno shaker per 12 minuti. Quindi rompere i grumi con una pipetta di plastica e continuare ad agitarsi per altri due o tre minuti fino a completa dejellied. Mantenere le uova fecondate sullo stesso piatto a 16 gradi Celsius o a temperatura ambiente.
Il giorno successivo, preparare il buffer di estrazione del DNA come descritto nel manoscritto, mescolare bene con il vortice e aliquotarlo in tubi PCR aggiungendo 20 microlitri a ciascun tubo. Sciogliere l'1% di agarosio in acqua di mare, versarlo in una piastra di Petri per coprire il fondo e raffreddare su un piano di panca per fare un letto in gel. Coprire il letto in gel con acqua di mare fresca.
Trasferire embrioni post-fecondazione 24 ore su 24 utilizzando una pipetta nella piastra di Petri contenente il letto in gel di agarosio. Inserire un ago di tungsteno in un supporto necessario e sterilizzare immergere la punta in alcool e posizionare in fiamme per bruciare l'alcol. Al microscopio sezionato, fare una depressione sull'agarosio usando l'ago di tungsteno per rimuovere un pezzo di agarosio superficiale delle dimensioni di un embrione da manipolare.
Quindi, usando l'ago di tungsteno, posizionare l'embrione nella depressione con il suo lato laterale rivolto verso il basso al fine di limitare il movimento dell'embrione per la microchirurgia. Al fine di eseguire un intervento chirurgico di successo, è fondamentale limitare il movimento dell'embrione. Con l'ago di tungsteno, rimuovere chirurgicamente un pezzo di tessuto aborale lungo l'asse aborale orale, situato di fronte all'apertura blastoporale orale.
Con una pipetta P20, trasferire il tessuto aborale isolato in un tubo PCR contenente 20 microlitri di tampone di estrazione del DNA. Trasferire l'embrione post-intervento chirurgico in un pozzo di una piastra di 24 po 'contenente almeno 500 microlitri di acqua di mare fresca. E posizionare la piastra contenente embrioni post-operatori in un'incubatrice a 16 gradi Celsius fino al completamento del genotipizzazione.
Per estrarre il DNA genomico da singoli embrioni, prima spingi brevemente giù i tubi PCR contenenti il tampone di estrazione del DNA e i tessuti embrionali isolati usando una mini centrifuga. Quindi incubare i tubi a 55 gradi Celsius per tre ore mentre si vortice per 30 secondi ogni 30 minuti per garantire la rottura dei grumi cellulari e migliorare la lisi cellulare. Dopo aver inattivato la proteinasi K a 95 gradi Celsius per quattro minuti, impostare una reazione PCR utilizzando il DNA genomico estratto come modello per amplificare il luogo di interesse.
Progettare i primer desiderati come descritto nel manoscritto. Impostare una reazione PCR a 20 microliter. Dopo aver completato la PCR, eseguire l'elettroforesi del gel di agarosio per determinare le dimensioni e la presenza o l'assenza di prodotti PCR, assicurandosi di regolare le condizioni dell'elettroforesi del gel di agarosio a seconda delle dimensioni previste dei prodotti PCR.
Utilizzare i risultati della PCR per quanto riguarda le dimensioni e la presenza o l'assenza o i prodotti PCR per assegnare un genotipo a ciascun embrione post-chirurgico e quindi ordinare gli embrioni in base al loro genotipo. Il genoma della nematostella ha un singolo locus che codifica una proteina precursore per il neuropeptide GLWamide. Tre alleli mutanti knockout al locus sono stati precedentemente segnalati.
I risultati della PCR da embrioni campionati casualmente tra la progenie di un incrocio di F1 tra una femmina eterozigote che porta un allele knockout A e maschi eterozigoti che portano un allele knockout C mostrano diversi genotipi. Gli embrioni uno e due mostrano una singola banda PCR corrispondente alla dimensione prevista di un allele knockout. Gli embrioni tre e sei mostrano due bande PCR con le dimensioni previste per gli alleli knockout A e C.Embryos quattro, sette e otto mostrano una singola banda PCR corrispondente alla dimensione prevista dell'allele knockout C.
L'embrione 5 non mostra bande, suggerendo la mancanza di legame del primer. Per escludere la possibilità di un fallimento dell'estrazione genomica del DNA, un altro PCR è stato eseguito utilizzando un primer inverso che può legarsi alla sequenza di tipo selvaggio. Dove è stato rilevato un prodotto PCR di dimensioni previste, l'estrazione genomica del DNA ha avuto successo.
Mentre nessun prodotto ha suggerito un guasto nell'estrazione. Sebbene questo protocollo sia progettato per gli embrioni di anemoni marini, sarà sicuramente possibile applicare questo metodo ad altri cnidari, come coralli e meduse, dove le informazioni genomiche e gli embrioni sono accessibili. Seguendo questa procedura, i mutanti identificati vengono utilizzati per valutare il fenotipo dello sviluppo.
Ad esempio, tecniche istologiche come l'immunostaining possono essere utilizzate per valutare difetti nella morfologia, mentre l'ibridazione in situ, l'RT-PCR quantitativo in tempo reale e l'RNA-seq possono essere utilizzate per valutare i difetti nell'espressione genica. Inoltre, l'imaging dal vivo può essere utilizzato per valutare difetti nel comportamento durante lo sviluppo post-embrionale, come nelle larve o nei primi polipi.
