이 프로토콜은 연구자가 초기 배아 발생 도중 돌연변이 바다 말미잘을 확인하는 것을 가능하게 하고 그 후 배아 발달 표현형을 분석할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동물의 생명을 희생하지 않고 초기에 개별 바다 말미잘을 유전자형으로 사용할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 실험실대학원생인 미겔 실바입니다.
산란 유도 전날, 말미네 선충성 베텐소를 온도 및 빛 제어 인큐베이터에 놓고 인큐베이터를 프로그래밍하여 동물이 섭씨 25도에서 8시간의 빛에 노출되도록 합니다. 다음 날, 인큐베이터에서 동물을 제거하고 다음 1 ~2 시간 이내에 발생하는 산란을 허용하기 위해 빛이 켜진 실온에서 벤치 상단에 둡니다. 팁이 절단된 이송 파이펫을 사용하여 여성 용기의 계란 패키지를 정자가 함유된 남성 용기에 넣고 수정을 허용하기 위해 최소 15분 동안 남성 용기에 두십시오.
수정 후, 계란 패키지를 dejelly, 유리 페트리 접시에 3 %의 시스테인을 포함하는 바닷물에 배치하고 부드럽게 12 분 동안 셰이커에 동요. 그런 다음 플라스틱 파이펫으로 덩어리를 부수고 완전히 벗어날 때까지 2 ~ 3 분 동안 계속 동요합니다. 수정된 계란을 같은 접시에 섭씨 16도 또는 실온에서 보관하십시오.
다음 날, 원고에 설명된 바와 같이 DNA 추출 버퍼를 준비하고, 소용돌이에 의해 잘 섞고, 각 튜브에 20 마이크로리터를 추가하여 PCR 튜브에 알리쿼트한다. 바닷물에 1%아가로즈를 녹이고, 페트리 접시에 붓고 바닥을 덮고, 벤치 상의를 식혀 젤 침대를 만듭니다. 젤 베드를 신선한 바닷물로 덮습니다.
파이펫을 사용하여 24시간 후 수정 배아를 아가로즈 젤 침대함유 페트리 접시에 옮기다. 텅스텐 바늘을 필요 홀더에 넣고 알코올에 팁을 찍어 화염에 넣고 알코올을 태우십시오. 해부 현미경하에서, 텅스텐 바늘을 사용하여 조작할 배아의 크기에 대한 표면 아가로즈 조각을 제거하여 아가로즈에 우울증을 만듭니다.
그런 다음 텅스텐 바늘을 사용하여 미세 수술용 배아의 이동을 제한하기 위해 측면측면이 아래로 향하는 우울증에 배아를 배치합니다. 성공적인 수술을 수행하기 위해서는 배아의 움직임을 제한하는 것이 중요합니다. 텅스텐 바늘로 구강 복부 축을 따라 복구 조직의 조각을 외과적으로 제거하십시오.
P20 파이펫을 사용하여, DNA 추출 버퍼의 20 마이크로리터를 포함하는 PCR 관에 격리된 복경 조직을 전송합니다. 수술 후 배아를 신선한 바닷물의 최소 500 마이크로리터를 포함하는 24웰 플레이트의 우물로 옮기. 그리고 수술 후 배아를 함유 한 플레이트를 지음이 완료 될 때까지 섭씨 16도에서 인큐베이터에 놓습니다.
단일 배아에서 게놈 DNA를 추출하기 위해 먼저 미니 원심분리기를 사용하여 DNA 추출 버퍼 및 격리된 배아 조직을 포함하는 PCR 튜브를 잠시 회전시합니다. 그런 다음 30분마다 30초 동안 튜브를 3시간 동안 55도의 배양하여 세포 덩어리가 분해되고 세포 용액을 향상시킵니다. 단백질Ae K를 섭씨 95도에서 4분간 비활성화한 후, 추출된 게놈 DNA를 사용하여 관심 있는 궤적을 증폭시키는 템플릿으로 PCR 반응을 설정한다.
원고에 설명된 대로 원하는 프라이머를 디자인합니다. 20 마이크로리터 PCR 반응을 설정합니다. PCR을 완료한 후, 아가로즈 젤 전기포고를 실행하여 PCR 제품의 크기와 존재 또는 부재를 결정하여 PCR 제품의 예상 크기에 따라 아가로즈 젤 전기포의 상태를 조절해야 합니다.
크기 및 존재 또는 부재 또는 PCR 제품에 관한 PCR 결과를 사용하여 각 수술 후 배아에 유전자형을 할당한 다음 유전자형에 따라 배아를 정렬하십시오. 선충성 게놈에는 신경 펩티드, GLWamide에 대한 전구체 단백질을 인코딩하는 단일 메뚜기를 가지고 있습니다. 궤적에서 3개의 녹아웃 돌연변이 진상골은 이전에 보고되었습니다.
PCR 결과는 C 녹아웃 유전자를 운반하는 A 녹아웃 알렐과 이종화구스 남성을 운반하는 한 이종화구스 여성 사이의 F1 십자가의 자손 중 무작위로 샘플링된 배아에서 유래하여 다른 유전자형을 보여준다. 배아 1개와 2개는 A 녹아웃 본선의 예상 크기에 해당하는 단일 PCR 대역을 보여준다. 배아 3개와 6개는 녹아웃 알레일 A와 C.Embryos 4, 7, 8에 대한 예상 크기를 가진 두 개의 PCR 밴드를 보여 주며, C 녹아웃 알렐의 예상 크기에 해당하는 단일 PCR 밴드를 보여준다.
배아 5는 프라이머 바인딩의 부족을 제안, 어떤 밴드를 보여줍니다. 유전체 DNA 추출 실패의 가능성을 배제하기 위해, 다른 PCR은 야생 형 서열에 결합 할 수있는 역 프라이머를 사용하여 실행되었다. 예상 크기의 PCR 생성물이 검출된 경우 게놈 DNA 추출이 성공했습니다.
어떤 제품도 추출에 실패를 제안하지 않은 반면. 이 프로토콜은 바다 말미잘 배아를 위해 설계되었지만, 게놈 정보와 배아가 접근 할 수있는 산호와 해파리와 같은 다른 cnidarians에이 방법을 적용 할 수 있습니다. 이 절차에 따라 확인된 돌연변이는 발달 표현형을 평가하는 데 사용됩니다.
예를 들어, 면역염색과 같은 조직학적 기술은 형태학의 결함을 평가하는 데 사용될 수 있으며, 시투 혼성화, 실시간 정량적 RT-PCR 및 RNA-seq는 유전자 발현의 결함을 평가하는 데 사용될 수 있다. 또한, 살아있는 화상 진찰은 애벌레 또는 초기 폴립에서와 같은 포스트 배아 발달 도중 행동에 있는 결함을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다.
