Este protocolo permite que um pesquisador identifique anêmonas marinhas mutantes durante a embrigênese precoce para que o fenótipo pós-embrionário possa ser analisado. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para genótipo de anêmonas marinhas individuais no início da ongênio sem sacrificar a vida do animal. Demonstrando esse procedimento será Miguel Silva, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.
No dia anterior à indução da desova, coloque a anêmona nematostella vectensis em uma incubadora controlada pela temperatura e luz, programando a incubadora para que os animais sejam expostos a oito horas de luz a 25 graus Celsius. No dia seguinte, retire os animais da incubadora e deixe-os em um banco em temperatura ambiente com a luz acesa para permitir a desova, que ocorrerá dentro de uma hora e meia a duas horas. Use uma pipeta de transferência que a ponta é cortada para ampliar a abertura para colocar embalagens de óvulos do recipiente feminino em um recipiente masculino contendo esperma e deixá-los no recipiente masculino por pelo menos 15 minutos para permitir a fertilização.
Após a fertilização, para dejelly as embalagens de ovos, coloque-os em água do mar contendo 3% de cisteína em uma placa de vidro Petri e agitar suavemente em um agitador por 12 minutos. Em seguida, separe os aglomerados com uma pipeta de plástico e continue agitando por mais dois ou três minutos até que completamente desembarado. Mantenha os ovos fertilizados no mesmo prato a 16 graus Celsius ou à temperatura ambiente.
No dia seguinte, prepare o tampão de extração de DNA como descrito no manuscrito, misture bem por vórtice e aliquot-lo em tubos PCR adicionando 20 microliters a cada tubo. Dissolva 1% de agarose na água do mar, despeje-a em uma placa de Petri para cobrir o fundo, e esfrie em um topo de banco para fazer uma cama de gel. Cubra o leito de gel com água doce do mar.
Transfira embriões pós-fertilização 24 horas usando uma pipeta na placa de Petri contendo gel de agarose. Insira uma agulha de tungstênio em um suporte de necessidade e esterilize mergulhando sua ponta em álcool e colocando-a em chamas para queimar o álcool. Sob um microscópio dissecando, faça uma depressão na ágarose usando a agulha de tungstênio para remover um pedaço de superfície que surgiu do tamanho de um embrião a ser manipulado.
Em seguida, usando a agulha de tungstênio, coloque o embrião na depressão com seu lado lateral voltado para baixo, a fim de restringir o movimento do embrião para microcirurgia. Para realizar uma cirurgia bem sucedida, é fundamental restringir o movimento do embrião. Com a agulha de tungstênio, remova cirurgicamente um pedaço de tecido aboral ao longo do eixo aboral oral, localizado em frente à abertura blastoporal oral.
Com uma pipeta P20, transfira o tecido aboral isolado para um tubo PCR contendo 20 microliters de tampão de extração de DNA. Transfira o embrião pós-cirurgia para um poço de uma placa de 24 poços contendo pelo menos 500 microliters de água doce do mar. E coloque a placa contendo embriões pós-cirurgia em uma incubadora a 16 graus Celsius até que a genotipagem seja concluída.
Para extrair DNA genômico de embriões únicos, primeiro gire brevemente os tubos PCR contendo o tampão de extração de DNA e tecidos embrionários isolados usando uma mini centrífuga. Em seguida, incubar os tubos a 55 graus Celsius por três horas enquanto o vórtice por 30 segundos a cada 30 minutos para garantir o rompimento de aglomerados celulares e melhorar a lise celular. Depois de inativar proteinase K a 95 graus Celsius por quatro minutos, configure uma reação pcr usando DNA genômico extraído como modelo para amplificar o lócus de interesse.
Projeto de primers desejados como descrito no manuscrito. Configure uma reação pcr de 20 microliter. Após a conclusão do PCR, execute a agarose gel eletrophoresis para determinar o tamanho e presença ou ausência de produtos PCR, certificando-se de ajustar a condição de eletroforese de gel agarose dependendo do tamanho esperado dos produtos PCR.
Use os resultados do PCR em relação ao tamanho e presença ou ausência ou produtos PCR para atribuir um genótipo a cada embrião pós-cirúrgico e, em seguida, classificar embriões de acordo com seu genótipo. O genoma nematostella tem um único lócus que codifica uma proteína precursora para o neuropeptídeo, GLWamide. Três alelos mutantes nocauteados no lócus foram previamente relatados.
PcR resulta de embriões amostrados aleatoriamente entre a prole de um cruzamento de F1 entre uma fêmea heterozigous carregando um alelo nocaute A e machos heterozigos carregando um alelo nocaute C mostram genótipos diferentes. Embriões um e dois mostram uma única banda PCR correspondendo ao tamanho esperado de A knockout alelo. Embriões três e seis mostram duas bandas PCR com os tamanhos esperados para os alelos nocauteados A e C.Embryos quatro, sete e oito mostram uma única banda PCR correspondente ao tamanho esperado de C knockout allele.
O embrião 5 não mostra bandas, sugerindo a falta de ligação de primer. Para descartar a possibilidade de falha genômica de extração de DNA, outro PCR foi executado usando um primer reverso que pode se ligar à sequência do tipo selvagem. Quando um produto PCR de tamanho esperado foi detectado, a extração genômica de DNA foi bem sucedida.
Considerando que nenhum produto sugeriu uma falha na extração. Embora este protocolo seja projetado para embriões de anêmona marinha, com certeza será possível aplicar esse método a outros cnidários, como corais e águas-vivas, onde informações genômicas e embriões são acessíveis. Após este procedimento, os mutantes identificados são usados para avaliar o fenótipo do desenvolvimento.
Por exemplo, técnicas histológicas como a imunostaining podem ser usadas para avaliar defeitos na morfologia, enquanto na hibridização in situ, RT-PCR quantitativo em tempo real e RNA-seq podem ser usados para avaliar defeitos na expressão genética. Além disso, imagens vivas podem ser usadas para avaliar defeitos de comportamento durante o desenvolvimento pós-embrionário, como em larvas ou em pólipos precoces.
