La digestion dépendante du DNAzyme est une méthode utile pour étudier les fonctions des snoARN. Il s’agit d’une méthode simple et rapide pour analyser la méthylation de l’ARN propre au site. Il nécessite un oligonucléotide d’ADN court et des reagents de base présents dans n’importe quel laboratoire de biologie moléculaire.
Commencez par concevoir le DNAzyme pour la séquence d’intérêt. Trouvez la séquence arn ou le site de méthylation putative à l’aide d’une base de données appropriée. Pour les cibles S.cerevisiae snoRNA, utilisez la base de données snoRNA levure.
Pour trouver un site de méthylation d’intérêt, par exemple, un site dépendant du snR13, sélectionnez snR13 et notez la position du nucléotide modifié. Trouvez la séquence en amont et en aval du nucléotide modifié à l’aide d’une base de données appropriée, telle que saccharomyces Genome Database. Recherchez le nom du gène cible.
Si vous utilisez un essai de 10 à 23 DNAzyme, sélectionnez 10 à 15 nucléotides en amont et en aval du site de méthylation. Si vous utilisez le DNAzyme 8-17, sélectionnez 20 nucléotides. Créez des séquences complémentaires des bras à cinq et trois premiers et utilisez-les pour flanquer la séquence catalytique DNAzyme aux extrémités à trois et cinq premiers.
Commandez le DNAzyme comme oligonucléotide normal d’ADN. Cultiver des souches de levure d’intérêt dans un milieu approprié et des conditions. Lorsque les cellules atteignent la phase exponentielle moyenne, pelletez-les en les centrifugant à 1000 fois g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius et jetez le milieu.
Procéder à l’isolement de l’ARN selon les directives manuscrites. Ensuite, réutilisez la pastille d’ARN dans 30 microlitres d’eau sans RNase et DNase. Placez le tube sur la glace et mesurez la concentration d’ARN sur un microspectrophotomètre.
Pour effectuer la digestion du DNAzyme à l’aide du DNAzyme de 10 à 23, préparez un mélange d’incubation avec cinq microgrammes d’ARN, 200 picomoles de 10 à 23 DNAzyme et un tampon d’incubation x 10 à 23 dans un volume total de 10 microlitres. Ensuite, incuber les tubes sur un bloc thermique sec réglé à 95 degrés Celsius pendant trois minutes. Immédiatement après, placez les tubes sur la glace et laissez-les là pendant cinq minutes.
Tournez brièvement les tubes et remets-les sur la glace. Ajouter 20 unités d’inhibiteur de la RNase et placer les tubes sur un bloc thermique sec réglé à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pendant ce temps, préparer un mélange de réaction en combinant cinq microlitres de tampon de réaction de quatre x 10 à 23 avec quatre microlitres de chlorure de magnésium de 300 molaires et une eau microlitre.
Préchauffer ce mélange de réaction sur un bloc thermique sec réglé à 37 degrés Celsius. Placez le tube avec le mélange d’incubation sur le bloc thermique sec de 37 degrés Celsius et ajoutez 10 microlitres du mélange de réaction préchauffé. Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant une heure, puis, placer le tube sur la glace.
Pour effectuer la digestion du DNAzyme à l’aide du DNAzyme 8-17, préparez un microtube de 1,5 millilitre avec cinq microgrammes d’ARN dans un volume total de six microlitres. Ensuite, préparer un tube séparé avec 400 picomoles de la DNAzyme 8-17. Pendant le travail, gardez les deux tubes sur la glace.
Transférer les deux tubes dans un bloc thermique sec réglé à 95 degrés Celsius et les incuber pendant deux minutes. Déplacez l’échantillon d’ARN sur la glace et faites tourner le tube avec le DNAzyme pendant cinq secondes. Incuber le DNAzyme à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Pendant que le DNAzyme est en incubation, préparez 10 mircoliters de tampon de réaction de deux X 8-17 et préchamez-le à 25 degrés Celsius. Ajouter le tampon préchauré au tube avec le DNAzyme, puis, transférer 14 microlitres de ce mélange de réaction au tube avec l’ARN, avec 20 unités d’inhibiteur de la RNase. Incuber la réaction à 25 degrés Celsius pendant deux heures, puis placer le tube sur la glace.
Pour purifier l’ARN après la digestion du DNAzyme, ajouter 350 microlitres d’eau et 400 microlitres de chloroforme au tube de réaction. Vortex pendant 30 secondes et centrifugeuse à 20 000 fois g pendant cinq minutes. Après centrifugation, transférer la phase supérieure dans un nouveau tube contenant un millilitre d’éthanol, 40 microlitres d’acétate d’ammonium de 7,5 molaires et un microlitre de glycogène.
Retournez le tube à quelques reprises pour mélanger et incuber soit à 80 degrés Celsius négatifs pendant deux heures ou à 20 degrés Celsius négatifs pendant la nuit. Procéder à la purification de l’ARN selon les instructions manuscrites, puis, re-suspendre la pastille d’ARN dans 10 microlitres RNase et DNase-libre d’eau. Placez le tube d’ARN sur la glace immédiatement après la purification.
Pour effectuer l’électrophoresis d’ARN, commencez par dissoudre 1,5 grammes d’agarose dans 127,5 millilitres d’eau distillée double en chauffant le mélange au micro-ondes. Ajoutez ensuite 15 millilitres de MOPS 10X et 7,5 millilitres de formaldéhyde à 37% à la solution agarose. Ajouter une quantité appropriée de tache de gel à la solution agarose.
Verser l’agarose dans le plateau et laisser refroidir pendant 45 minutes. Préparer les échantillons d’ARN en combinant 10 microlitres de l’ARN digéré et purifié avec cinq microlitres de tampon dénaturant l’échantillon et 0,5 microlitres de colorant de chargement de six X. Incuber les échantillons à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis sur la glace pendant cinq minutes.
Mettez le gel préparé dans le réservoir d’électrophoresis et remplissez le réservoir avec un tampon MOPS d’un X. Chargez les 15 microlitres entiers de l’échantillon sur le gel et exécutez le gel à 80 volts jusqu’à ce que le bleu bromothymol atteigne les 2/3 de la longueur du gel. Analyser le gel avec l’imageur approprié.
La valeur de cette technique peut être démontrée sur un système inductible de transcription de snoRNA. L’insertion d’un promoteur GAL1 inductible en amont des gènes snR13 ou snR47 permet d’analyser la méthylation dépendante de l’ARN ribosomal 25S. Lorsque les cellules sont cultivées sur la galactose, l’ARN ribosomal 25S est méthylé aux sites guidés par snoRNA et reste intact après le traitement au DNAzyme.
En revanche, lorsque l’expression de snoRNA est arrêtée en raison de l’absence de galactose, le clivage dépendant du DNAzyme se produit. En outre, aucune digestion d’ARN n’est observée dans les contrôles de type sauvage puisque l’expression de snoRNA est indépendante de galactose. L’activité du clivage dépendant du DNAzyme dans l’analyse de nos modifications rRNA a été montrée récemment dans le contexte de la maturation de snoRNA.
L’essai dépendant de DNAzyme a été employé pour montrer que l’absence du traitement de cinq-premier et pré-snoRNA affecte des niveaux de méthylation de 25S et de rRNA de 18S dans Saccharomyces cerevisiae. Ce protocole nécessite l’utilisation de phénol et de chloroforme, qui sont toxiques, et doivent être manipulés sous un capot de fumée.
