DNAzyme 의존성 소화는 스노나기능 연구를 위한 유용한 방법입니다. 사이트별 RNA 메틸화를 분석하는 빠르고 간단한 방법입니다. 그것은 어떤 분자 생물학 실험실에 존재하는 짧은 DNA 올리고뉴클레오티드 및 기본적인 시약을 요구합니다.
관심 의 순서에 대한 DNAzyme을 설계하여 시작합니다. 적절한 데이터베이스를 사용하여 RNA 서열 또는 putative 메틸화 부위를 찾아보십시오. S.cerevisiae snoRNA 표적의 경우 효모 스노RNA 데이터베이스를 사용합니다.
관심있는 메틸화 부위를 찾으려면, 예를 들어, snR13 의존 부위를 선택하여, snR13을 선택하고 수정된 뉴클레오티드의 위치를 기록한다. Saccharomyces 게놈 데이터베이스와 같은 적절한 데이터베이스를 사용하여 수정된 뉴클레오티드의 서열상류 및 하류를 찾아보십시오. 표적 유전자 이름을 검색합니다.
10 에서 23 DNAzyme 분석기를 사용하는 경우, 메틸화 부위의 상류 및 하류에서 10~ 15개의 뉴클레오티드를 선택한다. 8-17 DNAzyme를 사용하는 경우, 20개의 뉴클레오티드를 선택한다. 5프라임 및 3프라임 암의 보완적인 시퀀스를 만들고 이를 사용하여 3프라임 및 5프라임 엔드에서 DNAzyme 촉매 시퀀스를 측면에 넣습니다.
DNAzyme를 정상적인 DNA 올리고뉴클레오티드로 주문하십시오. 적절한 중간 및 조건에 관심효모 균주를 성장. 세포가 중간 지수 상에 도달하면, 4섭씨에서 3분 동안 1, 000배 g에서 원심분리하여 환원하여 배지를 폐기한다.
원고 방향에 따라 RNA 격리를 진행합니다. 그런 다음 RNase 및 DNase가 없는 물의 30 마이크로리터에서 RNA 펠릿을 다시 중단합니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 마이크로스펙트로포토미터에 RNA 농도를 측정합니다.
10~23개의 DNAzyme를 사용하여 DNAzyme 소화를 수행하려면 5마이크로그램의 RNA, 10~23DNAzyme의 200피코몰, 1-X 10~23개의 인큐베이션 버퍼를 총 10마이크로리터로 준비한다. 그런 다음, 3 분 동안 섭씨 95도로 설정 건조 열 블록에 튜브를 배양. 바로 그 후, 얼음에 튜브를 놓고 5 분 동안 거기에 둡니다.
튜브를 잠시 회전시키고 얼음위에 다시 놓습니다. RNase 억제제 20대를 추가하고 튜브를 섭씨 25도로 10분 간 건조 한 열 블록에 놓습니다. 한편, 4-X 10~23반응 버퍼 5개소와 300-해어 마그네슘 염화마그네슘 및 1개의 마이크로리터 워터를 결합하여 반응 혼합물을 준비한다.
이 반응 믹스를 섭씨 37도로 설정된 건조한 열 블록에 예열합니다. 37도 의 섭씨 건조 히트 블록에 인큐베이션 믹스와 튜브를 배치하고 사전 가열 반응 믹스의 10 마이크로 리터를 추가합니다. 혼합물을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양한 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
8-17 DNAzyme를 사용하여 DNAzyme 소화를 수행하기 위해 총 6마이크로리터의 총 부피에서 5 마이크로그램의 RNA를 사용하여 1.5 밀리리터 마이크로튜브를 준비합니다. 그런 다음 8-17 DNAzyme의 400 피코몰로 별도의 튜브를 준비합니다. 일하는 동안 두 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
두 튜브를 섭씨 95도로 설정된 건조한 열 블록으로 옮기고 2분 동안 배양합니다. RNA 샘플을 얼음에 다시 옮기고 DNAzyme로 튜브를 5초 동안 회전시합니다. DNAzyme을 섭씨 25도에서 10분 동안 배양합니다.
DNAzyme가 배양하는 동안, 2-X 8-17 반응 버퍼의 10 mircoliters를 준비하고 섭씨 25도에 예열. DNAzyme와 튜브에 미리 웜 버퍼를 추가 한 다음, RNase 억제제의 20 단위와 함께 RNA와 튜브에이 반응 믹스의 14 마이크로 리터를 전송합니다. 2시간 동안 섭씨 25도에서 반응을 배양한 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
DNAzyme 소화 후 RNA를 정화하려면 반응 튜브에 350 마이크로리터의 물과 400 마이크로리터의 클로로폼을 첨가하십시오. 30초 동안 소용돌이, 원심분리기는 20, 000배에서 5분간. 원심 분리 후, 상층부를 1밀리리터 에탄올, 7.5-어금다임 암모늄 아세테이트 40마이크로리터, 글리코겐 1마이크로리터를 포함하는 새로운 튜브로 옮긴다.
튜브를 몇 번 뒤집어 2시간 동안 마이너스 80도 또는 하룻밤 사이에 음수 섭씨 20도에서 혼합하고 배양하십시오. 원고 방향에 따라 RNA 정화를 진행한 다음, 10 개의 마이크로 리터 RNase 및 DNase가없는 물에서 RNA 펠릿을 다시 중단하십시오. 정제 직후 RNA 튜브를 얼음에 놓습니다.
RNA 전기포고를 수행하기 위해, 전자레인지에서 혼합물을 가열하여 이중 증류수 127.5밀리리터에서 1.5그램의 아가로즈를 용해하는 것으로 시작한다. 그런 다음 아가로즈 용액에 10X MOPS 15밀리리터와 37%의 포름알데히드 7.5 밀리리터를 추가합니다. 아가로즈 용액에 적절한 양의 젤 얼룩을 추가합니다.
아가로즈를 트레이에 붓고 45분간 식힙니다. 소화 및 정제 된 RNA의 10 마이크로 리터와 시료 분해 버퍼 5 마이크로 리터 및 6-X 로딩 염료의 0.5 마이크로 리터를 결합하여 RNA 샘플을 준비하십시오. 샘플을 섭씨 70도에서 5분간 배양한 다음 얼음위에 5분간 배양합니다.
준비된 젤을 전기전도 탱크에 넣고 탱크를 1-X MOPS 버퍼로 채웁니다. 샘플의 전체 15 마이크로리터를 젤에 적재하고 브로모티몰 블루가 젤 길이의 2/3에 도달할 때까지 80볼트에서 젤을 실행합니다. 적절한 이미저로 젤을 분석합니다.
이 기술의 가치는 유도 할 수없는 스노RNA 전사 시스템에서 입증 될 수있다. snR13 또는 snR47 유전자의 유도 가능한 GAL1 프로모터 업스트림을 삽입하면 25S 리보소말 RNA의 스노RNA 의존메틸화를 분석할 수 있습니다. 세포가 갈라토세에서 재배될 때, 25S 리보소말 RNA는 스노RNA 유도 부위에서 메틸화되고 DNAzyme 처리 후에 온전하게 유지됩니다.
대조적으로, 스노RNA 발현이 갈라토스의 부족으로 인해 차단되면, DNAzyme 의존분열이 발생한다. 더욱이, 스노RNA 발현이 독립적인 갈라토제이기 때문에 야생형 대조군에서 RNA 소화가 관찰되지 않는다. 우리의 rRNA 수정의 분석에 있는 DNAzyme 의존적인 분열의 활동은 snoRNA 성숙의 맥락에서 최근에 표시되었습니다.
DNAzyme 의존적 분석체는 5 프라임 및 프리 스노RNA 처리의 부족이 사카로미세스 cerevisiae에 있는 25S 및 18S rRNA의 메틸화 수준에 영향을 미친다는 것을 보여주기 위하여 이용되었습니다. 이 프로토콜은 독성이 있는 페놀과 클로로폼을 사용해야 하며 연기 후드 에서 처리해야 합니다.
