يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة مثل، كيف ينقي منتج الجينات الذي يصعب التعبير عنه في E.Coli. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنه لا يوجد تفاعل انزيمي ، بخلاف PCR ، هو الناقل ، ويمكن استخدام التطبيقات الشائعة لتنقية البروتين. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في تنقية البروتين في المكورات العقدية المتطاوعة، فإنه يمكن أيضا أن يكون على علم الأنواع الميكروبية الأخرى.
وسوف يكون إثبات الإجراء د.ماميكو ياماشيتا، طالب غراد من مختبرنا. بعد تصميم التمهيدي واستخراج الحمض النووي الجينومي من المكورات العقدية المتطاومة، تنفيذ PCR الأولى باستخدام المكورات العقدية البرية من النوع المتطاول وGFC تعطيل المكورات العقدية الطفرات الجينوم كقوالب PCR. تضخيم المناطق التي تؤوي الجزء المصب من جين gtfC وتلك التي تؤوي جين المقاومة spectinomycin باستخدام إعداد gtfC إلى الأمام واعكس التمهيدي وspc r إلى الأمام والمراحل العكسية.
ثم، electrophorese كل منتج PCR على 1٪ agarose هلام. استخدام الهلام bandcutter لاستخراج شظايا الحمض النووي المطلوب من ما يقرب من 1،000 أزواج قاعدة و 2،000 أزواج قاعدة من هلام إلى أنابيب microcentrifuge. إضافة 500 ميكرولترات من العازلة solubilizing في كل أنبوب واحتضان لهم لمدة 10 دقيقة في 56 درجة مئوية لإذابة شرائح هلام.
تنقية الشظايا باستخدام السيليكا الغشاء القائم على طريقة استخراج هلام. تنفيذ PCR الثاني باستخدام منتجات PCR الأول كقوالب PCR مع التمهيديات المتداخلة إلى الأمام وتكتل عكس. عندما لا يمكن تأكيد المنتج PCR الثاني بواسطة electrophoresis، يجب تصميم زوج التمهيدي متداخلة آخر.
الكهرباء خمسة ميكروليترات من خليط PCR على هلام agarose. تأكيد توليد أمبيركون المناسبة من حوالي 3،000 أزواج قاعدة بواسطة ethidium بروميد هلام تلطيخ صورة والمضي قدما وفقا للمخطوطة. الآن، مزيج خمسة ميكرولترات من المنتج PCR الثاني المركزة إلى aloquot 50 ميكرولتر من الجليد الباردة، المختصة البرية من النوع العقديات الخلايا المتنية، المجمدة سابقا.
يُضاف الخليط إلى الكوفيت الكهربائي ثم نضع الكوفيت في غرفة cuvette في جهاز الإلكتروبوريشن. إعطاء نبضة كهربائية واحدة من 1.8 كيلوفولت، 600 أوم، و 10 microfarads لمدة 2.5 مللي ثانية إلى الخلايا. إضافة 500 ميكرولترات من مرق ضخ الدماغ والقلب في cuvette.
انتشرت على الفور 10 إلى 100 ميكرولترات من التعليق على الدماغ القلب ضخ لوحات أوبر التي تحتوي على سبكتينوميسين. احتضان لوحات لمدة يومين إلى ستة أيام في 37 درجة مئوية حتى المستعمرات نمت بما فيه الكفاية ليتم التقاطها. بعد جيل من المكورات العقدية المتطاولة تسلسل الترميز polyhistidine أدرجت سلالة والتلقح بين عشية وضحاها دون spectinomycin وفقا للمخطوطة، الطرد المركزي تعليق الثقافة البكتيرية لمدة 20 دقيقة في 10،000 مرات ز في أربع درجات مئوية.
نقل الثقافة فائقة إلى كوب زجاجي ثلاثة لتر. لتركيز البروتينات من عظمى الثقافة، ضع السوبر لترين على مُحرك مغناطيسي وابدأ في التحريك القوي. إضافة 1، 122 غراما من كبريتات الأمونيوم والسماح للترسب لتشكيل مع اثارة قوية في أربع درجات مئوية على مدى فترة أربع ساعات أو بين عشية وضحاها. التالي.
أجهزة الطرد المركزي كبريتات الأمونيوم عجلت في 15، 000 مرات ز لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. اِنّهُ المُنَاَعِيّ. مع ملعقة، وجمع الترسب ونقله إلى كوب زجاجي 200 ملليلتر.
resuspend الكريات في 35 ملليلتر من العازلة ملزمة. ثم, نقل كل ما يقرب من 25 ملليلتر من التعليق في أنابيب غسيل الكلى السليلوز مجددة. ضع أنابيب غسيل الكلى في 2.5 لتر من الحاجز الربط التحريك على مُحرك في أربع درجات مئوية لـ dialyze التعليق.
استبدل محلول غسيل الكلى بعد ساعتين، وتواصل غسيل الكلى طوال الليل. نقل المقبل تعليق dialyzed من أنابيب إلى أنابيب الطرد المركزي ووضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي في 20،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. مع قسم الترشيح المعدات، صب سوبرنات على 0.2 ميكرومتر مرشح غشاء لتصفية.
نقل الترشيح إلى قارورة 75 ملليلتر. لكسر gtfSI الموسومة ببولي هيستيدين من التعليق المرشّح، قم أولاً بإعداد كروماتوغرافيا معدنية غير ثابتة. بعد اكويفيرتينج الراتنج وفقا للمخطوطة، أغلق ديك قرصة هوفمان.
إضافة خمسة ملليلتر من التعليق الذي تمت تصفيته في العمود لجعل الطين. ثم، نقل كل الطين إلى التعليق المتبقية المصفاة ودوامة الخليط بلطف لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. قم بتحميل الخليط مرة أخرى إلى العمود.
فتح ديك قرصة هوفمان لإزالة تعليق من تدفق الجاذبية. غسل راتنج IMAC مع 20 ملليلتر من العازلة ملزمة ومن ثم، elute 20 ملليلتر من عازلة elution للحصول على gtfSI المؤتلف. بعد ذلك، تحميل eluate في أنبوب الترشيح فائقة الطرد المركزي والطرد المركزي الحل في 2، 000 مرات ز لمدة دقيقة إلى خمس دقائق لتركيز الحل.
إفراغ حاوية الترشيح وإضافة 15 ملليلتر من المخزن المؤقت في أنبوب. الطرد المركزي العينة مرة أخرى، وتكرار العملية مرتين إضافية. وأخيراً يتركز الحل gtfSI المؤتلف إلى ما يقرب من ملليلتر واحد.
نقل التركيز إلى أنبوب microcentrifuge وتخزينها في أربع درجات مئوية. متابعة مع بقية بروتوكول استعادة وظيفية. في هذا البروتوكول، يظهر الـ agarose gel electrophoresis أن حجم كل أمبيركون من PCR الأول والثاني PCR يتوافق مع الحجم المتوقع.
تم تحويل مستعمرات المكورات العقدية مع المنتج PCR الثاني ومطلية على لوحات أوجر ضخ الدماغ والقلب التي تحتوي على سبتينوميسين. تظهر منتجات PCR مستعمرة تشغيل على هلام agarose أن كل أمبيركون كان من الحجم المتوقع. وقد لوحظ البروتين المنقى مع الكروماتوغرافيا تقارب المعادن غير المُشلَّم كقناة واحدة بواسطة SDS-PAGE.
وأكدت البقعة الغربية، التي أجريت باستخدام الأجسام المضادة للبوليهيستادين، أن النطاق المرصود هو البروتين الموسوم بالبولي هيستيدين المتوقع البالغ 160 كيلودالطن. وقد شوهد فقط القدرة على تشكيل بيو فيلم مشتق من السكروز مع المكورات العقدية المتواطن البرية من النوع والcoccus العقدية الطفرات His-gtfC، والتي شكلت بيو فيلم مُلتمس على جدار الأنبوب في وجود 1٪sucrose. ولم يلاحظ ذلك في المكورات العقدية المتطاة دلتا gtfC.
ومع ذلك ، فإن إضافة 25 ميكروغرام من gtfSI المؤتلف أعاد القدرة على تكوين بيو فيلم في العقديات المتوات دلتا gtfC. منذ نجاح هذه الطريقة يعتمد على تضخيم PCR الثاني، يجب تأكيد المنتج PCR الثاني بواسطة الكهرباء. بالفعل، البروتين من نوع الهستيدين التي تم الحصول عليها من خلال هذه الطريقة هو أيضا الدعوة إلى الأحماض الوظيفية، مثل البروتين البروتين التفاعلات.
بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية ، بالاشتراك مع اضطراب الجينات ، الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء الدقيقة لاستكشاف وظيفة الجينات.
