Bu yöntem mikrobiyoloji alanındaki anahtar soruların cevaplatına yardımcı olabilir, örneğin E.Coli'de ifade etmesi zor bir gen ürünü nasıl arındırır. Bu tekniğin başlıca avantajları, PCR dışında hiçbir enzimatik reaksiyonun taşıyıcı olmaması ve protein saflaştırma için yaygın uygulamalar da kullanılabildiğidir. Bu yöntem streptococcus mutans protein saflaştırma içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda diğer mikrobiyota türleri için bir haberdar olabilir.
Prosedürü gösteren Dr.Mamiko Yamashita, bizim laboratuvardan yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Streptococcus mutans primer tasarım ve genomik DNA çıkarma sonra, yabani tip streptococcus mutans ve GFC pcr şablonları olarak streptococcus mutans genom bozulmuş kullanarak ilk PCR gerçekleştirmek. GtfC geninin aşağı kısmını barındıran bölgeleri ve hazırlanan gtfC-ileri ve ters astar ı ve spc r-ileri ve ters astarı kullanarak spektinomisin direnç genini barındıran bölgeleri güçlendirin.
Daha sonra, % 1 agarose jel her PCR ürün elektrofore. Mikrosantrifüj tüpler içine jel yaklaşık 1.000 baz çiftleri ve 2.000 baz çiftleri istenilen DNA parçaları çıkarmak için bir jel bandcutter kullanın. Her tüp içine çözünen tampon 500 mikrolitre ekleyin ve jel dilimleri eritmek için 56 santigrat derece onları 10 dakika kuluçka.
Silika membran bazlı jel çıkarma yöntemi ile parçaları arındırın. İç içe ve iç içe dönük ve iç içe dönük astarlarla PCR şablonları olarak ilk PCR'nin ürünlerini kullanarak ikinci bir PCR gerçekleştirin. İkinci PCR ürünü elektroforez ile teyit edilemiyorsa, başka bir iç içe astar çifti tasarlanmalıdır.
agarose jel üzerinde PCR karışımı nın elektrofore beş mikrolitre. Ethidium bromür jel boyama görüntüsü ile yaklaşık 3.000 baz çifti uygun amplicon üretimi onaylayın ve el yazmasına göre devam edin. Şimdi, konsantre ikinci PCR ürününün beş mikrolitresini buz gibi 50 mikrolitrelik aloquot'a karıştırın.
Bir elektroporasyon cuvette içine karışımı ekleyin ve elektroporasyon cihazının cuvette odasına cuvette yerleştirin. Hücrelere 2,5 milisaniye boyunca 1.8 kilovolt, 600 ohm ve 10 mikrofarad içeren tek bir elektrik darbesi verin. Cuvette içine beyin-kalp infüzyon suyu 500 mikrolitre ekleyin.
Hemen beyin-kalp infüzyon ütektürin plakaları üzerine spektinomisin içeren süspansiyon 10 ila 100 mikrolitre yayıldı. Koloniler toplanacak kadar büyüyene kadar plakaları 37 derecede 2-6 gün kuluçkaya yatırın. Streptococcus mutans polihistidine kodlama dizisi nin nesil sonra el yazmasına göre sitomisin olmadan gerginlik ve gece aşılama dahil, 10 dakika boyunca bakteri kültürü süspansiyon santrifüj, 4 santigrat derece g 000 kez.
Kültür supernatant üç litrelik cam kabı içine aktarın. Kültür supernatant proteinleri konsantre etmek için, bir manyetik karıştırıcı üzerine iki litrelik supernatant yerleştirin ve güçlü karıştırma başlar. Amonyum sülfat 1, 122 gram ekleyin ve dört saatlik bir süre içinde veya bir gecede dört derece santigrat güçlü karıştırma ile çökelti oluşmasını sağlar. Sonraki.
amonyum sülfat çözeltisi 15, 000 kez g 4 santigrat derece 20 dakika için çökelti çözeltisi santrifüj. Süpernatant'ı decant. Bir spatula ile, çökelti toplamak ve 200 mililitrelik cam kabı içine aktarın.
Bağlayıcı tampon 35 mililitre pelet resuspend. Daha sonra, her biri yaklaşık 25 mililitre süspansiyonu rejenere olmuş selüloz diyaliz tüpüne aktarın. Süspansiyon diyaliz için dört derece santigrat bir karıştırıcı üzerinde karıştırma bağlayıcı tampon 2,5 litre içine diyaliz tüpü yerleştirin.
Diyaliz solüsyonunu iki saat sonra değiştirin ve bir gece boyunca diyalize devam edin. Sonraki transfer hortum tüpleri için boru dan diyaliz süspansiyon ve santrifüj tüpleri yerleştirin 20, 000 kez g dört derece santigrat 10 dakika boyunca. Kesit filtrasyon ekipmanları ile, filtre lemek için 0,2 mikrometrelik membran filtre üzerine supernatant dökün.
Filtrat'ı 75 mililitrelik bir şişeye aktarın. Polihistidin etiketli gtfSI'yi filtröz süspansiyondan ayırmak için önce immobilize metal afinite kromatografisi hazırlayın. El yazmasına göre rezorini dengeledikten sonra Hoffman çimdik sikini kapatın.
Bir bulamaç yapmak için sütuna filtrelenmiş süspansiyon beş mililitre ekleyin. Daha sonra, kalan filtrelenmiş süspansiyon tüm bulamaç aktarın ve yavaşça dört derece santigrat 30 dakika boyunca karışımı girdap. Karışımı sütuna geri yükleyin.
Yerçekimi akışı ile süspansiyon kaldırmak için Hoffman çimdik horoz açın. IMAC reçisini 20 mililitre bağlayıcı tamponla yıkayın ve rekombinant gtfSI elde etmek için 20 mililitre elüsyon tamponu temizler. Bundan sonra, bir santrifüj ultra filtrasyon tüpü içine eluate yükleyin ve çözelti konsantre bir ila beş dakika için 2,000 kez g çözeltisi santrifüj.
Filtrat kabını boşaltın ve tüpe 15 mililitre depolama tamponu ekleyin. Numuneyi tekrar santrifüj edin ve işlemi iki kez daha tekrarlayın. Rekombinant gtfSI çözeltisi nihayet yaklaşık bir mililitreye konsantre edilir.
Bir mikrocentrifuge tüp içine konsantre aktarın ve dört santigrat derece de saklamak. Geri kalan fonksiyonel restorasyon protokolüne devam edin. Bu protokolde, agarose jel elektroforez ilk PCR ve ikinci PCR her amplicon boyutu öngörülen boyutu ile karşılık geldiğini gösterir.
Streptococcus mutans kolonileri ikinci PCR ürünü ile dönüştürüldü ve spektinomisin içeren beyin-kalp infüzyon üğnlü plakalar üzerine kaplandı. Agarose jel üzerinde çalışan Colony PCR ürünleri her amplicon öngörülen boyutu olduğunu gösterir. SDS-PAGE tarafından immobilize metal afinite kromatografisi ile saflaştırılmış protein tek bant olarak gözlendi.
Anti-polihistidin antikor kullanılarak yapılan batı lekesi, gözlenen bandın 160 kilodaltonun beklenen polihistidin etiketli proteini olduğunu doğruladı. Sakaroz kaynaklı biyofilm şekillendirme yeteneği sadece streptococcus mutans yabani tip ve streptokok mutans His-gtfC ile görüldü, hangi tüp duvarında bir yapışık biyofilm oluşan 1%sakaroz varlığında. Bu streptokok mutans delta gtfC gözlenmemiştir.
Ancak, rekombinant gtfSI 25 mikrogram eklenmesi streptococcus mutans delta gtfC yapışık biyofilm oluşum yeteneğini geri. Bu yöntemin başarısı ikinci PCR amplifikasyonuna bağlı olduğundan, ikinci PCR ürünü elektroforez ile teyit edilmelidir. Zaten bu yöntemle elde edilen histidin tipi protein, protein-protein etkileşimleri gibi fonksiyonel asitlere de bir araya gelmektedir.
Gelişiminden sonra, bu teknik, gen bozulması ile birlikte, mikrobiyoloji alanında araştırmacılar ın gen fonksiyonunu keşfetmelerinin önünü açtı.
