لأول مرة أنشأنا تعديل الجينات المشفرة لGABAA ionotropic ومستقبلات الغلوتامات metabotropic في مجموعات فرعية من الخلايا العصبية في الدماغ نحلة العسل الكبار. يمكن استخدام تحرير الجينات CRISPR-Cas9 لتعديل جين واحد أو عدة جينات في أدمغة النحل البالغين لاستكشاف أدوارهم في التعلم والذاكرة في ظل ظروف مختبرية خاضعة للرقابة. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة وظيفة بروتينات محددة في النحل البالغ ، وكذلك لاختبار خصوصية الأجسام المضادة ضد البروتينات المقابلة لها.
إظهار الإجراء مع إيرينا سيناكيفتش سيكون ليف كورتزمان وهيون تشوي، طلاب جامعيين سابقين من مختبري. لاختبار التعبير عن RDL و mGlutR1 عن طريق التحليل المناعي الكيميائي بعد حقن CRISPR-Cas9 ، أولاً ، استخدم أداة CRISPR-Cas9 عبر الإنترنت لتصميم الأدلة باستخدام تسلسل الحمض النووي الدليلي لـ apis mellifera و RDL و mGlutR1. لإعداد دليل تشكيلات مجمع RNA لكل RNA دليل، تسمية أنبوب اختبار واحد لكل دليل مع اسم RNA الدليل، وإضافة 92 ميكرولترات من العازلة خالية من النيوكليوتيد، وأربعة ميكرولترات من 100 fluorophore ميكرومولار، وصفت transactivating RNA كريسبر، وأربعة ميكرولترات من دليل المناسبة RNA الحل لكل أنبوب.
عندما يتم إضافة جميع المواد، اخلطي الحلول بلطف وتدور محتويات الأنبوب في جهاز طرد مركزي على مقاعد البدلاء لمدة خمس ثوان لرواسب الحل. ثم، والحفاظ على حلول ل95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لإنشاء مجمع RNA دليل تليها 10 دقيقة تهدئة في درجة حرارة الغرفة. لإعداد تشكيلات مجمع ribonucleoprotein إضافة ستة ميكرولترات من كل دليل RNA الحل وستة ميكرولترات من 0.5 ميكروغرام لكل ميكرولتر SP-Cas9 النوى V3 إلى أنابيب المسمى بشكل مناسب.
بعد خلط لطيف، احتضان الحلول في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لجعل RNP مخاليط ريبونوكليوبروتين للحقن، في نهاية الحضانة إضافة أربعة ميكرولترات من كل ribonucleoprotein إلى RDL المناسبة. لجعل السيطرة، لا دليل RNA الحل مزيج أربعة ميكرولترات من الحمض النووي الريبي مع 92 ميكرولترات من العازلة وأربعة ميكرولترات من الماء. بعد إضافة الماء، والحفاظ على المحلول لمدة خمس دقائق في 95 درجة مئوية والسماح للخليط لتهدئة حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.
ثم، مزيج ستة ميكرولترات من الحل لا دليل RNA مع ستة ميكرولترات من 0.5 ميكروغرام لكل ميكرولتر Cas9 نوى 3. لحقن خليط ribonucleoprotein ، بعد التقاط النحل الفردي في قوارير مع ثقب صغير في القبعات ، قم بشل النحل لمدة لا تزيد عن ثلاث دقائق على الجليد وتأمين كل النحل إلى حاملات المعادن المعدة مسبقًا مع الشريط اللاصق. مع الصدر الخلفي، أجنحة والرأس مكشوفة. استخدام حقنة خمسة ملليلتر لإطعام النحل مع محلول السكروز الضرس واحد حتى أنها لم تعد جائعا، ووضع النحل المضمون في مربع مع منشفة ورقية مبللة للرطوبة.
بعد ذلك، ضع الشمع على داخل أغطية طبقين من الأطباق بتري 35 ملليلتر ووضع قيعان الأطباق على الشمع. حقن واحد السكروز الضرس بين الغلاف وأسفل كل طبق، ووضع طبق بتري تغذية واحدة في مربع أبيض مع شريحة زجاجية واحدة ووضع الآخر في مربع أسود مع شريحة زجاجية واحدة. ثم، وضع مشط صغير في كل مربع وتحميل نظام الحقن المجهري مع الخليط RDL CRISPR-Cas9.
لحقن RDL CRISPR-Cas9، حقن متوسط أوسيلي من ثمانية النحل مع 345 نانويتلتر من مزيج RDL ribonucleoprotein تليها التغذية مع واحد مولر السكروز قبل الإفراج عن النحل في مربع تجريبي أسود. تغذية مجموعة ثانية من ثمانية النحل والضوابط دون أي حقن والإفراج عنهم في مربع التحكم الأبيض. ثم، ضع كلا الصندوقين في حاوية البوليسترين مع ورقة مبللة، ومراقبة النحل مرتين في اليوم لضمان أن لديهم ما يكفي من الطعام والرطوبة الجيدة.
بعد 48 ساعة من الحقن ، قم بشل النحل على الجليد لمدة 30 ثانية واستخدم المقص لقطع رأس كل حشرة. وضع رؤساء في 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني تحت مجهر تشريح في غطاء الدخان، واستخدام مقص قزحية الباركير بعناية ولكن بسرعة إزالة الهوائيات، عيون المركب، وأعلى الهيكل الخارجي. السماح للرؤساء للجلوس في حل التثبيت لمدة 10 دقائق قبل إزالة بقية الهيكل العظمي exo من الرأس وجميع القصبة الهوائية المتبقية.
ثم, وضع كل دماغ في أنبوب 1.5 ميلليلتر microcentrifuge التي تحتوي على ما لا يقل عن ملليلتر واحد من 4٪ شبهformaldehyde بين عشية وضحاها في أربع إلى ثماني درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، إضافة 3.8 غرام من الأرغروز إلى 50 ملليلتر من الماء المقطر في قارورة erlenmeyer وميكروويف الحل حتى liquifies أرجروز. نقل ثلاثة إلى أربعة أدمغة نحل العسل ثابتة في طبق جديد بتري 35 ملليمتر واستخدام ورقة الأنسجة لإزالة مثبت الزائدة.
صب بعناية argrose السائل على الأدمغة وتوجيه العينات داخل أرجروز بحيث تواجه الفصوص الهوائيات. بعد أن توطدت الأرغروز، استخدم مشرط لقطع كتل فردية من الأرغروز تحتوي على دماغ واحد وملء كل بئر من لوحة 24-well محملة بسلة واحدة مع قاع شبكة مزهر و600 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في البئر. ثم، استخدم هزاز للحصول على 70 ميكرومتر مقطعاً من أنسجة الدماغ من كل كتلة أرجروز.
وضع المقاطع من دماغ واحد على شبكة من سلة واحدة كما يتم الحصول عليها. بعد وضع العلامات على الأقسام مع الأجسام المضادة الفلورومترية ، وفقًا للبروتوكولات القياسية ، قم بتضمين كل شريحة مع أقسام من دماغ واحد باستخدام قطرة من المتوسط المتصاعد وتصور العينات عن طريق المجهر المفلور. المضادة ل RDL تسميات المواليد في القسم الأمامي من نوع البرية، ولكن ليس CRISPR-Cas9 RDL أدمغة النحل بالضربة القاضية.
ولوحظت خصوصية مماثلة للأجسام المضادة للأجسام المضادة لـ mGlutR1. في هذه الممثلة، كمية PCR إسقاط الاختبارات في أدمغة النحل حقن RDL CRIPSR-Cas9، والتخفيض النسبي للفلوريسانس تتوافق مع عدد الحمض النووي الدليل المعدل في العينة. بعد حقن mGlutR1 CRISPR-Cas9 ، كان التعديل النسبي للحمض النووي الإرشادي حوالي 59٪ في أدمغة النحل المحقون مقارنة بالحمض النووي الإرشادي الملاحظ في أدمغة النحل غير المحقون.
في هذا الكمية RT-PCR في مجموعة منفصلة من النحل كان الانخفاض النسبي للرسول RNA RDL ما يقرب من 59٪ مقارنة بمستوى الحمض النووي الريبي في النحل غير المحقون، والانخفاض النسبي للرسول mGlutR1 RNA في النحل المحقون كان تقريبا 53٪ بشكل ملحوظ، حقن RDL CRISPR-Cas9 من خلال أوسيلي قد لا تصل دائما إلى عدد كبير من خلايا الدماغ. على سبيل المثال، في هذه الاستعدادات واحد فقط يكون من أصل ثمانية كان RDL CRISPR-Cas9 في أعداد كبيرة من خلايا الدماغ مقارنة بأدمغة النحل الأخرى. مع RDL CRISPR-Cas9 تتركز داخل خلايا بروتوسيريبروم، ولكن ليس الفص الهوائي.
تأكد من تجنب RNA المجمدة و rna refrozen. الحرص على عدم الإفراط في اكول النحل. تسخير لهم على الفور مرة واحدة في وقف التحرك في القارورة.
ويمكن استخدام هذه التقنية لدراسة آثار الحد من مستقبلات ionotropic ومثبطات metabotropic في الجسم الفطر ومجمع مركزي على سلوك نحل العسل.
