Por primera vez hemos establecido una modificación de los genes codificados para GABAA ionotrópico y receptores de glutamato metabotrópicos en subconjuntos de neuronas en el cerebro adulto de la abeja miel. La edición de genes CRISPR-Cas9 se puede utilizar para modificar uno o varios genes en cerebros adultos de abejas para explorar sus funciones en el aprendizaje y la memoria bajo condiciones de laboratorio controladas. Este método se puede utilizar para estudiar la función de proteínas específicas en las abejas adultas, así como para probar la especificidad de los anticuerpos contra sus proteínas correspondientes.
Demostrando el procedimiento con Irina Sinakevitch serán Lev Kurtzman y Hyun Choi, ex estudiantes de mi laboratorio. Para probar la expresión de RDL y mGlutR1 mediante análisis inmunocitoquímicos después de la inyección DE CRISPR-Cas9, primero, utilice una herramienta en línea CRISPR-Cas9 para diseñar las guías utilizando la secuencia de ADN guía de apis mellifera, RDL y mGlutR1. Para preparar formaciones complejas de ARN guía para cada ARN guía, etiquete un tubo de ensayo para cada guía con el nombre del ARN guía, y agregue 92 microlitros de tampón libre de nucleótidos, cuatro microlitros de 100 fluoróforos micromolares, ARN CRISPR transactivado etiquetado y cuatro microlitros de la solución de ARN guía adecuada para cada tubo.
Una vez añadidos todos los materiales, mezcle las soluciones suavemente y gire el contenido del tubo en una centrífuga de sobremesa durante cinco segundos para sedimentar la solución. A continuación, mantenga las soluciones a 95 grados centígrados durante cinco minutos para crear un complejo de ARN guía seguido de 10 minutos de enfriamiento a temperatura ambiente. Para preparar las formaciones complejas de ribonucleoproteína añadir seis microlitros de cada solución de ARN guía y seis microlitros de 0,5 microgramos por microlitro SP-Cas9 nucleasa V3 a los tubos debidamente etiquetados.
Después de una mezcla suave, incubar las soluciones a 37 grados Celsius durante 10 minutos Para hacer mezclas de ribonucleoproteína RNP para inyección, al final de la incubación añadir cuatro microlitros de cada ribonucleoproteína al RDL apropiado. Para realizar un control, la solución de ARN sin guía mezcla cuatro microlitros de ARN trazador con 92 microlitros de tampón y cuatro microlitros de agua. Después de la adición de agua, mantener la solución durante cinco minutos a 95 grados Celsius y dejar que la mezcla se enfríe hasta que alcance la temperatura ambiente.
A continuación, mezcle seis microlitros de la solución de ARN sin guía con seis microlitros de 0,5 microgramos por microlitros Cas9 nuclese V3. Para la inyección de mezcla de ribonucleoproteína, después de capturar abejas individuales en viales con un pequeño agujero en las tapas, inmovilice las abejas durante no más de tres minutos en hielo y asegure cada abeja en soportes metálicos previamente preparados con cinta adhesiva. Con el tórax trasero, las alas y la cabeza expuestas. Utilice una jeringa de cinco mililitros para alimentar a las abejas con una solución de sacarosa molar hasta que ya no tengan hambre, y coloque las abejas aseguradas en una caja con una toalla de papel húmeda para la humedad.
A continuación, coloque la cera en el interior de las tapas de dos platos petri de 35 mililitros y coloque los fondos de los platos sobre la cera. Inyecte una sacarosa molar entre la cubierta y la parte inferior de cada plato, y coloque un plato de petri de alimentación en una caja blanca con un portaobjetos de vidrio y coloque el otro en una caja negra con un portaobjetos de vidrio. A continuación, coloque un peine pequeño en cada caja y cargue un sistema de microinyección con la mezcla RDL CRISPR-Cas9.
Para la inyección de RDL CRISPR-Cas9, inyecte la mediana de ocho abejas con 345 nanolitros de mezcla de ribonucleoproteína RDL seguido de la alimentación con una sacarosa molar antes de liberar las abejas en la caja experimental negra. Alimentar un segundo conjunto de ocho abejas como controles sin ninguna inyección y liberarlos en la caja de control blanca. A continuación, coloque ambas cajas en un recipiente de poliestireno con papel húmedo, observando las abejas dos veces al día para asegurarse de que tienen suficiente comida y una buena humedad.
48 horas después de la inyección, inmovilizar las abejas en hielo durante 30 segundos y utilizar tijeras para decapitar a cada insecto. Coloque las cabezas en 4%paraformaldehído EN PBS bajo un microscopio diseccionado en una campana de humo, y use tijeras de iris barraquer para quitar cuidadosamente pero rápidamente las antenas, los ojos compuestos y el exoesqueleto superior. Deje que las cabezas se sienten en la solución fijadora durante 10 minutos antes de retirar el resto del esqueleto de exo de la cabeza y toda la tráquea restante.
Luego, coloca cada cerebro en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga al menos un mililitro de 4%paraformaldehído durante la noche a cuatro a ocho grados centígrados. A la mañana siguiente, añadir 3,8 gramos de argrose a 50 mililitros de agua destilada en un matraz de erlenmeyer y microondas la solución hasta que la argrose se liquifiera. Transfiera de tres a cuatro cerebros de abejas de miel fijos a una nueva placa de petri de 35 milímetros y use papel tisú para eliminar el exceso de fijador.
Verter cuidadosamente la argrose líquida sobre los cerebros y orientar las muestras dentro de la argrosa para que los lóbulos de las antenas estén mirando hacia arriba. Después de que la argrose se haya solidificado, utilice un bisturí para cortar bloques individuales de argrose que contengan un solo cerebro y llene cada pozo de una placa de 24 pozos cargada con una cesta con un fondo de malla hidrófoba y 600 microlitros de PBS por pozo. Luego, usa un vibratome para adquirir secciones transversales de 70 micrómetros del tejido cerebral de cada bloque de argrose.
Colocar las secciones de un solo cerebro en la malla de la misma cesta a medida que se adquieren. Después de etiquetar las secciones con anticuerpos conjugados con fluoróforo, de acuerdo con los protocolos estándar, incruste cada diapositiva con secciones de un solo cerebro utilizando una gota de medio de montaje y visualice las muestras mediante microscopía de fluorescencia. Anti-RDL etiqueta las neuropilas en la sección frontal de tipo salvaje, pero no en cerebros de abejas nocaut CRISPR-Cas9 RDL.
Se observó una especificidad similar para los anticuerpos anti-mGlutR1. En estas pruebas cuantitativas de caída de PCR en cerebros de abejas inyectados con RDL CRIPSR-Cas9, la reducción relativa de la fluoresencia correspondió al número del ADN guía modificado en la muestra. Después de la inyección de mGlutR1 CRISPR-Cas9, la modificación relativa del ADN guía fue de aproximadamente el 59% en los cerebros de las abejas inyectadas en comparación con el ADN guía observado en los cerebros de las abejas no inyectadas.
En este RT-PCR cuantitativo en un grupo separado de abejas, la reducción relativa del ARN RDL mensajero fue de aproximadamente el 59%en comparación con el nivel de ARN en las abejas no inyectadas, y la reducción relativa del ARN mGlutR1 del mensajero en las abejas inyectadas fue aproximadamente del 53%, en particular, la inyección de RDL CRISPR-Cas9 a través del ocelli podría no llegar siempre a un gran número de células cerebrales. Por ejemplo, en estas preparaciones sólo uno debe estar de ocho años con RDL CRISPR-Cas9 en un gran número de células cerebrales en comparación con otros cerebros de abejas. Con el RDL CRISPR-Cas9 concentrado dentro de las células del protocerebrum, pero no el lóbulo antena.
Asegúrese de evitar el ARN congelado y rerozen. Tenga cuidado de no enfendir las abejas. Aprovecharlos inmediatamente una vez que deje de moverse en el vial.
Esta técnica se puede utilizar para estudiar los efectos de la reducción de los receptores ionotrópicos y metabotrópicos inhibitorios en el cuerpo de la seta y complejo central en el comportamiento de la abeja miel.
