Per la prima volta abbiamo stabilito una modifica dei geni codificati per gabaa ionotropico e recettori del glutammato metabotropico in sottoinsiemi di neuroni nel cervello adulto delle api melme. L'editing genico CRISPR-Cas9 può essere utilizzato per modificare uno o più geni nel cervello delle ape adulte per esplorare i loro ruoli nell'apprendimento e nella memoria in condizioni di laboratorio controllate. Questo metodo può essere utilizzato per studiare la funzione di proteine specifiche nelle api adulte, nonché per testare la specificità degli anticorpi contro le loro proteine corrispondenti.
A dimostrare la procedura con Irina Sinakevitch saranno Lev Kurtzman e Hyun Choi, ex studenti universitari del mio laboratorio. Per testare l'espressione di RDL e mGlutR1 mediante analisi immunocitochimica dopo l'iniezione CRISPR-Cas9, in primo luogo, utilizzare uno strumento CRISPR-Cas9 online per progettare le guide utilizzando la sequenza di DNA guida di api mellifera, RDL e mGlutR1. Per preparare formazioni complesse di RNA guida per ogni RNA guida, etichettare una provetta per ogni guida con il nome dell'RNA guida e aggiungere 92 microlitri di tampone privo di nucleotidi, quattro microlitri di fluoroforo micromolare, RNA CRISPR transattivato etichettato e quattro microlitri dell'appropriata soluzione di RNA guida per ogni tubo.
Una volta aggiunti tutti i materiali, mescolare delicatamente le soluzioni e ruotare il contenuto del tubo in una centrifuga da banco per cinque secondi per sedimentare la soluzione. Quindi, mantenere le soluzioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti per creare un complesso di RNA guida seguito da un raffreddamento di 10 minuti a temperatura ambiente. Per preparare le formazioni complesse di ribonucleoproteina aggiungere sei microlitri di ciascuna soluzione di RNA guida e sei microlitri di 0,5 microgrammi per microlitro SP-Cas9 nucleasi V3 ai tubi opportunamente etichettati.
Dopo una miscelazione delicata, incubare le soluzioni a 37 gradi Celsius per 10 minuti Per fare miscele di ribonucleoproteina RNP per iniezione, al termine dell'incubazione aggiungere quattro microlitri di ogni ribonucleoproteina all'RDL appropriato. Per effettuare un controllo, la soluzione di RNA senza guida mescola quattro microlitri di RNA tracciante con 92 microlitri di tampone e quattro microlitri di acqua. Dopo l'aggiunta di acqua, mantenere la soluzione per cinque minuti a 95 gradi Celsius e lasciare raffreddare la miscela fino a raggiungere la temperatura ambiente.
Quindi, mescolare sei microlitri della soluzione di RNA senza guida con sei microlitri da 0,5 microgrammi per microlitro Cas9 nucleasi V3. Per l'iniezione di miscela di ribonucleoproteina, dopo aver catturato singole api in fiale con un piccolo foro nei tappi, immobilizzare le api per non più di tre minuti sul ghiaccio e fissare ogni ape in supporti metallici precedentemente preparati con nastro adesivo. Con il torace posteriore, le ali e la testa esposte. Utilizzare una siringa da cinque millilitri per nutrire le api con una soluzione di saccarosio molare fino a quando non hanno più fame e posizionare le api protette in una scatola con un tovagliolo di carta bagnato per l'umidità.
Quindi, posizionare la cera all'interno dei coperchi di due piastre di Petri da 35 millilitri e posizionare i fondi dei piatti sulla cera. Iniettare un saccarosio molare tra il coperchio e il fondo di ogni piatto e posizionare una piastra di petri alimentazione in una scatola bianca con uno scivolo di vetro e posizionare l'altra in una scatola nera con uno scivolo di vetro. Quindi, posizionare un piccolo pettine in ogni scatola e caricare un sistema di microiniezione con la miscela RDL CRISPR-Cas9.
Per l'iniezione DI RDL CRISPR-Cas9, iniettare gli ocelli mediani di otto api con 345 nanolitri di mix RDL di ribonucleoproteina seguito dall'alimentazione con un saccarosio molare prima di rilasciare le api nella scatola sperimentale nera. Alimentare un secondo set di otto api come controlli senza iniezioni e rilasciarle nella scatola di controllo bianca. Quindi, posizionare entrambe le scatole in un contenitore di polistirolo con carta bagnata, osservando le api due volte al giorno per assicurarsi che abbiano abbastanza cibo e una buona umidità.
48 ore dopo l'iniezione, immobilizzare le api sul ghiaccio per 30 secondi e utilizzare le forbici per decapitare ogni insetto. Posizionare le teste in paraformaldeide AL PBS al microscopio sezionato in una cappa aspirante e utilizzare forbici per iris barraquer per rimuovere con attenzione ma rapidamente le antenne, gli occhi composti e l'esoscheletro superiore. Lasciare riposare le teste nella soluzione fissante per 10 minuti prima di rimuovere il resto dello scheletro di eso dalla testa e tutta la trachea rimanente.
Quindi, posizionare ogni cervello in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente almeno un millilitro di paraformaldeide durante la notte a quattro-otto gradi Celsius. La mattina successiva, aggiungere 3,8 grammi di argrose a 50 millilitri di acqua distillata in un pallone erlenmeyer e microonde la soluzione fino a quando l'argrose liquirifica. Trasferire da tre a quattro cervelli di api da miele fissi in una nuova piastra di Petri da 35 millimetri e utilizzare carta velina per rimuovere l'eccesso fissativo.
Versare con cura l'argrose liquido sul cervello e orientare i campioni all'interno dell'argrose in modo che i lobi delle antenne siano rivolti verso l'alto. Dopo che l'argrose si è solidificato, utilizzare un bisturi per tagliare singoli blocchi di argrose contenenti un singolo cervello e riempire ogni pozzo di una piastra da 24 po 'caricata con un cesto con fondo a rete idrofobica e 600 microlitri di PBS per pozzo. Quindi, usa un vibratomo per acquisire sezioni trasversali di 70 micrometri del tessuto cerebrale da ogni blocco di argrose.
Posizionando le sezioni da un singolo cervello sulla rete dello stesso cesto man mano che vengono acquisite. Dopo aver etichettato le sezioni con anticorpi coniugati al fluoroforo, secondo i protocolli standard, incorporare ogni diapositiva con sezioni di un singolo cervello utilizzando una goccia di mezzo di montaggio e visualizzare i campioni mediante microscopia a fluorescenza. L'anti-RDL etichetta i neuropils nella sezione frontale del cervello delle ape knockout CRISPR-Cas9 RDL.
Una specificità simile è stata osservata per gli anticorpi anti-mGlutR1. In questi test di consegna PCR rappresentativi e quantitativi nel cervello delle api iniettati con RDL CRIPSR-Cas9, la riduzione relativa della fluorescenza corrispondeva al numero del DNA guida modificato nel campione. Dopo l'iniezione di mGlutR1 CRISPR-Cas9, la relativa modifica del DNA guida è stata di circa il 59% nel cervello delle api iniettate rispetto al DNA guida osservato nel cervello delle api non iniettate.
In questo rt-PCR quantitativo in un gruppo separato di api la riduzione relativa dell'RNA messaggero RDL era di circa il 59% rispetto al livello di RNA nelle api non iniettate, e la riduzione relativa dell'RNA messaggero mGlutR1 nelle api iniettate era di circa il 53%In particolare, l'iniezione di RDL CRISPR-Cas9 attraverso gli ocelli potrebbe non sempre raggiungere un gran numero di cellule cerebrali. Ad esempio, in questi preparati solo uno su otto aveva RDL CRISPR-Cas9 in un gran numero di cellule cerebrali rispetto ad altri cervelli delle ape. Con l'RDL CRISPR-Cas9 concentrato all'interno delle cellule del protocerebrum, ma non il lobo antennale.
Assicurati di evitare l'RNA congelato e rifozen. Fai attenzione a non raffreddamento eccessivamente le api. Sfruttali immediatamente una volta che l'arresto si muove nel flaconcino.
Questa tecnica può essere utilizzata per studiare gli effetti della riduzione dei recettori ionotropici e metabotropici inibitori nel corpo dei funghi e nel complesso centrale sul comportamento delle api melisce.
