Впервые мы установили модификацию генов, кодируемых для ионотропных ГАМК и метаботропных рецепторов глутамата в подмножествах нейронов во взрослом мозге медоносных пчел. Редактирование генов CRISPR-Cas9 может быть использовано для изменения одного или нескольких генов в мозге взрослых пчел, чтобы исследовать их роль в обучении и памяти в контролируемых лабораторных условиях. Этот метод может быть использован для изучения функции конкретных белков у взрослых пчел, а также для проверки специфичности антител против соответствующих белков.
Демонстрацией процедуры с Ириной Синакевич будут Лев Курцман и Хён Чой, бывшие студенты моей лаборатории. Чтобы проверить экспрессию RDL и mGlutR1 с помощью иммуноцитохимического анализа после инъекции CRISPR-Cas9, во-первых, используйте онлайн-инструмент CRISPR-Cas9 для разработки руководств с использованием последовательности ДНК руководства apis mellifera, RDL и mGlutR1. Чтобы подготовить руководство РНК сложных образований для каждого руководства РНК, этикетка одной пробирки для каждого руководства с именем руководства РНК, и добавить 92 микролитров нуклеотид-свободного буфера, четыре микролитров 100 микромолярный фторфор, помечены трансактивации CRISPR РНК, и четыре микролитров соответствующего решения РНК руководства для каждой трубки.
Когда все материалы были добавлены, смешайте растворы осторожно и спина трубки содержимое в скамейке верхней центрифуги в течение пяти секунд, чтобы отложения раствора. Затем держите растворы до 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут, чтобы создать направляющий РНК-комплекс с последующим 10-минутным остыть при комнатной температуре. Для подготовки рибонуклеопротеиновых комплексных образований добавьте шесть микролитров каждого направляющий РНК-раствор и шесть микролитров по 0,5 микрограмма на микролитер SP-Cas9 nuclease V3 к соответствующим помеченным трубкам.
После нежного смешивания, инкубировать растворы при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут, чтобы сделать RNP рибонуклеопротеин смеси для инъекций, в конце инкубации добавить четыре микролитров каждого рибонуклеопротеина в соответствующий RDL. Чтобы сделать контроль, нет-руководство РНК решение смешать четыре микролитров трассировщик РНК с 92 микролитров буфера и четыре микролитров воды. После добавления воды, держать раствор в течение пяти минут при температуре 95 градусов по Цельсию и дайте смеси остыть, пока не достигнет комнатной температуры.
Затем смешайте шесть микролитров раствора РНК без руководства с шестью микролитерами по 0,5 микрограмма на микролитер Cas9 nuclease V3. Для инъекции рибонуклеопротеина смесь, после захвата отдельных пчел во флаконах с небольшим отверстием в шапках, обездвижить пчел в течение не более трех минут на льду и обеспечить каждую пчелу в ранее подготовленных металлических держателей с клейкой лентой. С задней грудной клеткой, крыльями и головой подвергаются. Используйте пятими миллилитровый шприц, чтобы накормить пчел одним раствором мохлолярной сахарозы, пока они больше не голодны, и поместите обеспеченных пчел в коробку с мокрым бумажным полотенцем для влажности.
Затем поместите воск на внутренней стороне крышки двух 35 миллилитров чашек Петри и поместите дно посуды на воск. Ввести одну молярную сахарозу между крышкой и дном каждой тарелки и поместите одну кормовую чашку Петри в белую коробку с одной стеклянной горкой и поместите другую в черный ящик с одним стеклянным слайдом. Затем поместите небольшой гребень в каждую коробку и загрузите систему микроинъекции смесью RDL CRISPR-Cas9.
Для инъекций RDL CRISPR-Cas9 ввисьйте средний очелли из восьми пчел с 345 нанолитров рибонуклеопротеина RDL смеси с последующим кормлением одной молярной сахарозой, прежде чем выпустить пчел в черный экспериментальный ящик. Кормите второй набор из восьми пчел в качестве элементов управления без каких-либо инъекций и отпустите их в белую коробку управления. Затем поместите обе коробки в контейнер из полистирола с мокрой бумагой, наблюдая за пчелами два раза в день, чтобы убедиться, что у них достаточно пищи и хорошая влажность.
Через 48 часов после инъекции обездвижить пчел на льду в течение 30 секунд и использовать ножницы, чтобы обезглавить каждое насекомое. Поместите головы в 4%paraformaldehyde В PBS под рассекающий микроскоп в дым капот, и использовать ножницы ириса барракер тщательно, но быстро удалить антенны, сложные глаза, и верхний экзоскелет. Разрешить головы сидеть в фиксаторном растворе в течение 10 минут, прежде чем удалить остальную часть скелета экзо из головы и все остальные трахеи.
Затем поместите каждый мозг в 1,5 миллилитр микроцентрифуг трубки, содержащей по крайней мере один миллилитр 4%paraformaldehyde ночь на четыре-восемь градусов по Цельсию. На следующее утро добавьте 3,8 грамма аргрозы в 50 миллилитров дистиллированной воды в эрленмейерную колбу и микроволновую печь раствор до тех пор, пока арроуз не заклеется. Перенесите три-четыре фиксированных мозга медоносных пчел в новую 35-миллиметровую чашку Петри и используйте тканевую бумагу, чтобы удалить избыток фиксатора.
Тщательно налейте жидкую аргрозу на мозг и сориентировать образцы в аргрозе так, чтобы антенны доли лицом вверх. После того, как аргроз затвердел, используйте скальпель, чтобы вырезать отдельные блоки аргрозы, содержащие один мозг и заполнить каждый колодец 24-хорошо пластины загружены с одной корзины с гидрофобной сетки дно и 600 микролитров PBS на колодец. Затем используйте вибром для приобретения 70 микрометровых поперечных сечений ткани мозга из каждого блока аргрозы.
Размещение секций из одного мозга на сетку той же корзины, как они приобретены. После маркировки секций с флюорофором конъюгированных антител, в соответствии со стандартными протоколами, вставлять каждый слайд с разделами из одного мозга с помощью капли монтажной среды и визуализировать образцы с помощью флуоресценции микроскопии. Анти-RDL этикетки нейропилов в лобной части дикого типа, но не CRISPR-Cas9 RDL нокаутом пчел мозга.
Аналогичная специфичность наблюдалась и в анти-mGlutR1 антителах. В этих репрезентативных, количественных ПЦР высадить тесты в мозг пчел вводили с RDL CRIPSR-Cas9, относительное снижение флуоресентности соответствует числу модифицированных ДНК руководства в образце. После инъекции mGlutR1 CRISPR-Cas9 относительная модификация направляющих ДНК составила примерно 59% в мозге инъекционных пчел по сравнению с ДНК гида, наблюдаемой в мозге не введенных пчел.
В этой количественной RT-PCR ina отдельная группа пчел относительное сокращение посыльного РНК RDL составило приблизительно 59% по сравнению с уровнем РНК у не вводили пчел, и относительное сокращение посыльного mGlutR1 РНК у инъекционных пчел было примерно 53%, Примечательно, что инъекция RDL CRISPR-Cas9 через ocelli не всегда может достичь большого количества клеток мозга. Например, в этих препаратах только один из восьми имел RDL CRISPR-Cas9 в большом количестве клеток мозга по сравнению с другими мозгами пчел. С RDL CRISPR-Cas9 сосредоточены в клетках протосеребрума, но не антенной доли.
Будьте уверены, чтобы избежать замороженных и переделом РНК. Позаботьтесь, чтобы не перекоола пчел. Используйте их немедленно, как только перестанет двигаться во флаконе.
Этот метод может быть использован для изучения влияния сокращения ингибирующие ионотропные и метаботропные рецепторы в грибном организме и центральный комплекс на поведение медоносных пчел.
