使用CRISPR-Cas9在蜜蜂脑科进行抗RDL和抗mGGR1受体抗体测试

我们首次对成人蜜蜂大脑中神经元子集中编码的基因进行改性，即同性GABAA和代谢性谷氨酸受体。CRISPR-Cas9基因编辑可用于修改成年蜜蜂大脑中的一个或多个基因，以探索它们在受控实验室条件下在学习和记忆中的角色。该方法可用于研究成年蜜蜂中特定蛋白质的功能，以及测试抗体与相应蛋白质的特异性。

与伊琳娜·西纳凯维奇一起演示这个程序的将是列夫·库尔茨曼和贤崔，他们来自我的实验室的前本科生。要在CRISPR-Cas9注射后通过免疫细胞化学分析测试RDL和mGlutR1的表达，首先，使用在线CRISPR-Cas9工具使用apis mellifera、RDL和mGlutR1的引导DNA序列设计指南。为准备每个引导RNA的导导RNA复杂地层，为每个导管RNA标记一个试管，并添加92微升无核苷酸缓冲液、4个100微摩尔氟磷微升、标记的转导CRISPRRNA和4个微升适当的引导RNA溶液。

添加所有材料后，轻轻混合溶液，并在台式离心机中旋转管内装物五秒钟，以沉淀溶液。然后，将溶液保持至 95 摄氏度 5 分钟，以创建引导 RNA 复合物，然后在室温下冷却 10 分钟。为了准备核糖核酸蛋白复合层，将每个引导RNA溶液的6微升和每微升SP-Cas9核酸酶V3的6微升添加到适当标记的管中。

轻轻混合后，在37摄氏度下孵育溶液10分钟，使RSP核糖核酸蛋白混合物进行注射，在孵化结束时，将每种核糖核酸蛋白的四微升添加到适当的RDL中。为了进行控制，无导RNA溶液将4微升示踪RNA与92微升缓冲液和4微升水混合。加水后，将溶液保持5分钟，在95摄氏度下，让混合物冷却，直到达到室温。

然后，将无导导RNA溶液的6微升与6微升，每微升Cas9核酸酶V30.5微升。对于核糖核酸蛋白混合物注射，在捕获小瓶中的单个蜜蜂后，在瓶盖上有一个小孔，在冰上固定蜜蜂不超过三分钟，用胶带将每只蜜蜂固定在先前准备的金属支架中。后胸，翅膀和头部暴露。使用五毫升注射器用一个摩尔蔗糖溶液喂蜜蜂，直到它们不再饥饿，并将安全蜜蜂放在一个盒子里，用湿纸巾进行湿度。

接下来，将蜡放在两个 35 毫升培养皿的盖子内侧，将盘子的底部放在蜡上。在每个菜的盖子和底部之间注入一个摩尔蔗糖，用一个玻璃滑梯将一个喂食的培养皿放入白盒中，用一个玻璃幻灯片将另一个放入黑盒中。然后，将一个小梳子放入每个包装盒中，用 RDL CRISPR-Cas9 混合物加载微注射系统。

对于 RDL CRISPR-Cas9 注射，将 8 只蜜蜂的中微量注入 345 纳米糖蛋白 RDL 混合物，然后用一种摩尔蔗糖喂养，然后将蜜蜂释放到黑色实验盒中。将第二组八只蜜蜂作为控制装置喂给，无需任何注射，然后将它们释放到白色控制盒中。然后，将两个盒子放入一个装有湿纸的聚苯乙烯容器中，每天观察蜜蜂两次，以确保它们有足够的食物和良好的湿度。

注射48小时后，将蜜蜂固定在冰上30秒，用剪刀斩首每只昆虫。将头部放在 4%的甲醛 IN PBS 中，放在烟罩的解剖显微镜下，并使用巴拉克虹膜剪刀小心但快速去除天线、复合眼和顶部外骨骼。让头部在固定溶液中坐10分钟，然后从头部和所有剩余的气管中取出其余的外骨骼。

然后，将每个大脑放在一个1.5毫升的微离心管中，在4至8摄氏度下过夜，含有至少1毫升4%的甲状甲醛。第二天早上，在埃伦迈尔烧瓶中加入3.8克的蒸馏水，微波溶液，直到砷气。将三到四个固定的蜜蜂大脑转移到一个新的35毫米的培养皿中，并使用纸巾去除多余的固定剂。

小心地将液体气糖倒在大脑上，将样品定向到砷的内，使天线叶朝上。凝固后，用手术刀切出含有单个大脑的单独块，并填充一个24井板的每一个井，里面装着一个篮子，每个井有一个疏水网底和600微升的PBS。然后，使用振动器从每个气量块获得70微米的脑组织横截面。

将单个大脑的部分放在获取时同一篮子的网格上。根据标准协议，在用荧光结合抗体标记各部分后，使用一滴安装介质将每个幻灯片与单个大脑的部分嵌入，然后通过荧光显微镜将样本可视化。抗 RDL 在野生类型的前部标记神经皮， 但不是 CRISPR - Cas9 RDL 敲除蜜蜂大脑。

对抗mGlutR1抗体观察到类似的特异性。在这些具有代表性的定量PCR下降测试蜜蜂大脑注射RDL CRIPSR-Cas9，荧光的相对减少对应于样本中修改的指南DNA的数量。mGlutR1 CRISPR-Cas9注射后，与非注射蜜蜂大脑中观察到的引导DNA相比，注射蜜蜂大脑中引导DNA的相对修饰约为59%。

在这个定量的RT-PCR中，信使RNA RDL的相对减少率比非注射蜜蜂的RNA水平要低约59%，而注射蜜蜂中的信使mGlutR1RNA的相对减少量约为53%，特别是通过ocelli注射RDLCRISPR-Cas9可能并不总是达到大量的脑细胞。例如，在这些制剂中，与其他蜜蜂大脑相比，八分之一的脑细胞中只有一个具有大量脑细胞。RDL CRISPR-Cas9 集中在原体细胞内，而不是天线叶。

一定要避免冷冻和重新冷冻RNA。小心不要使蜜蜂过冷。一旦小瓶停止移动，立即利用它们。

该技术可用于研究减少蘑菇体内抑制性免疫受体和代谢受体对蜜蜂行为的影响。