בפעם הראשונה הקמנו שינוי של הגנים מקודד עבור גאבא ionotropic קולטני גלוטמט metabotropic ב subsets של נוירונים במוח דבורת הדבש למבוגרים. ניתן להשתמש בעריכת גנים CRISPR-Cas9 כדי לשנות גנים אחד או יותר במוחות של דומים בוגרים כדי לחקור את תפקידם בלמידה ובזיכרון בתנאי מעבדה מבוקרים. שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד את הפונקציה של חלבונים ספציפיים ב bees למבוגרים, כמו גם כדי לבדוק את הספציפיות של נוגדנים נגד החלבונים המתאימים שלהם.
הדגמת ההליך עם אירינה סינקוביץ' תהיה לב קורצמן ויון צ'וי, סטודנטים לשעבר מהמעבדה שלי. כדי לבדוק את הביטוי של RDL ו- mGlutR1 על ידי ניתוח אימונוציטוכימי לאחר הזרקת CRISPR-Cas9, ראשית, השתמש בכלי CRISPR-Cas9 מקוון כדי לעצב את המדריכים באמצעות רצף ה- DNA המדריך של apis mellifera, RDL ו- mGlutR1. כדי להכין תצורות מורכבות RNA מדריך עבור כל מדריך RNA, תווית מבחנה אחת עבור כל מדריך עם שם המדריך RNA, ולהוסיף 92 microliters של מאגר ללא נוקלאוטייד, ארבעה microliters של 100 פלואורופור מיקרומולר, שכותרתו ביצוע CRISPR RNA, וארבעה microliters של פתרון RNA מדריך המתאים לכל צינור.
לאחר הוספת כל החומרים, מערבבים את הפתרונות בעדינות ומסובבים את תכולת הצינור בצנטריפוגה על הספסל במשך חמש שניות כדי לגרד את הפתרון. לאחר מכן, שמרו על הפתרונות ל-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי ליצור מתחם RNA מדריך ואחריו 10 דקות של קירור בטמפרטורת החדר. כדי להכין את תצורות מורכבות ribonucleoprotein להוסיף שישה microliters של כל פתרון RNA מדריך ושישה microliters של 0.5 מיקרוגרם לכל microliter SP-Cas9 נוקלאז V3 לצינורות שכותרתו כראוי.
לאחר ערבוב עדין, הדגירה את הפתרונות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להפוך RNP ריבונוקלאופרוטאין תערובות להזרקה, בסוף הדגירה להוסיף ארבעה microliters של כל ריבונוקלאופרוטאין RDL המתאים. כדי ליצור בקרה, פתרון RNA ללא מדריך לערבב ארבעה microliters של RNA tracer עם 92 microliters של חיץ וארבעה microliters של מים. לאחר הוספת מים, לשמור על הפתרון במשך חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס ולאפשר את התערובת להתקרר עד שהוא מגיע לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, לערבב שישה microliters של פתרון RNA ללא מדריך עם שישה microliters של 0.5 מיקרוגרם לכל microliter Cas9 נוקלאז V3. עבור הזרקת תערובת ריבונוקלאופרוטאין, לאחר לכידת יהיווים בודדים בבקבוקונים עם חור קטן בכספו, שתק את הפולים למשך לא יותר משלוש דקות על הקרח ואבטח כל דבורה למחזיקי מתכת שהוכנו בעבר עם סרט הדבקה. עם בית החזה האחורי, הכנפיים והראש חשופים. השתמש מזרק חמישה מיליליטר להאכיל את המצעים עם פתרון סוכרוז טוחנת אחת עד שהם כבר לא רעבים, ומניחים את המצעים המאובטחים בקופסה עם מגבת נייר רטובה ללחות.
לאחר מכן, מניחים שעווה על החלק הפנימי של המכסים של שתי מנות פטרי 35 מיליליטר ומ מניחים את החלק התחתון של הכלים על השעווה. מזריקים סוכרוז טוחנת אחת בין המכסה לתחתית כל מנה, ומנחים צלחת פטרי אחת מאכילה בקופסה לבנה עם מגלשת זכוכית אחת ומנחים את השנייה בקופסה שחורה עם מגלשת זכוכית אחת. לאחר מכן, מניחים מסרק קטן לתוך כל תיבה לטעון מערכת microinjection עם תערובת RDL CRISPR-Cas9.
להזרקת RDL CRISPR-Cas9, הזריקו את האוצ'לי החציוני של שמונה מצעים עם 345 ננוליטרים של תערובת ריבונוקלאופרוטאין RDL ואחריה האכלה עם סוכרוז טוחנת אחת לפני שתשחררו את הסלק לתוך תיבת הניסוי השחורה. להאכיל קבוצה שנייה של שמונה 20 פעמים כמו פקדים ללא כל זריקות ולשחרר אותם לתוך תיבת הבקרה הלבנה. לאחר מכן, מניחים את שתי הקופסאות במיכל פוליסטירן עם נייר רטוב, מתבוננים בפוליות פעמיים ביום כדי להבטיח שיש להן מספיק אוכל ולחות טובה.
48 שעות לאחר ההזרקה, לשתק את ה דבורים על קרח במשך 30 שניות ולהשתמש מספריים כדי לערוף את ראשו של כל חרק. מניחים את הראשים ב-4% paraformaldehyde IN PBS תחת מיקרוסקופ לנתח במכסה המנוע של אדים, ולהשתמש במספריים של איריס barraquer כדי להסיר בזהירות אך במהירות את האנטנות, העיניים המורכבות, ואת השלד החיצוני העליון. אפשר לראשים לשבת בתתכנון התיקון במשך 10 דקות לפני הסרת שאר שלד האקסו מהראש ואת כל קנה הנשימה הנותר.
לאחר מכן, מניחים כל מוח בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל לפחות מיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde לילה בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, להוסיף 3.8 גרם של ארגוז ל 50 מיליליטר של מים מזוקקים בבקבוק erlenmeyer ומיקרוגל הפתרון עד liquifies argrose. מעבירים שלושה עד ארבעה מוחות דבורת דבש קבועים לצלחת פטרי חדשה של 35 מילימטרים ולהשתמש בנייר טישו כדי להסיר את התיקון העודף.
בזהירות לשפוך את הנוזל התעורר על המוח ולכוון את הדגימות בתוך התעוררות כך אונות האנטנות פונים כלפי מעלה. לאחר שהתעוררות התגבשה, השתמש באזמל כדי לחתוך בלוקים בודדים של ארגרוז המכילים מוח אחד ולמלא כל באר של צלחת 24 באר טעון עם סל אחד עם תחתית רשת הידרופובית ו 600 microliters של PBS לבא. לאחר מכן, השתמש רטט לרכוש 70 חתך מיקרומטר של רקמת המוח מכל בלוק argrose.
הצבת החלקים ממוח אחד על רשת של אותו סל כפי שהם נרכשים. לאחר תיוג החלקים בנוגדנים נדפנים פלואורופור, על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, להטמיע כל שקופית עם חלקים ממוח אחד באמצעות טיפה של מדיום הרכבה לדמיין את הדגימות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות. Anti-RDL מתייג נוירופילים בחלק הקדמי של מוחות נוקאאוט מסוג פראי, אך לא פריספר-Cas9 RDL.
ספציפיות דומה נצפתה עבור נוגדנים נגד mGlutR1. בנציגים אלה, בדיקות שחרור PCR כמותית במוחות דבורים מוזרק עם RDL CRIPSR-Cas9, ההפחתה היחסית של הפלואורסצנטיות תאמה את מספר ה- DNA מדריך שונה המדגם. לאחר הזרקת mGlutR1 CRISPR-Cas9, השינוי היחסי של הדנ"א המדריך היה כ-59% במוחן של המצעים המוזרקים בהשוואה לדנ"א המדריך שנצפה במוחן של מצעים שאינם מוזרקים.
בקבוצה כמותית זו RT-PCR ina קבוצה נפרדת של דומים ההפחתה היחסית של השליח RNA RDL היה כ 59% לעומת רמת RNA ב- 2000 לא מוזרק, ואת ההפחתה היחסית של השליח mGlutR1 RNA ב bees מוזרק היה כ 53%יש לציין, הזרקת RDL CRISPR-Cas9 דרך ocelli לא תמיד יכול להגיע למספר גדול של תאי מוח. לדוגמה, בהכנות אלה רק אחד להיות מתוך שמונה היה RDL CRISPR-Cas9 במספר גדול של תאי מוח בהשוואה למוחות דומים אחרים. עם RDL CRISPR-Cas9 מרוכז בתוך התאים של אב הדרך, אבל לא את האונה אנטנה.
הקפד להימנע RNA קפוא refrozen. תדאג לא להעיף את הפולים. רתום אותם מיד לאחר הפסקת התנועה בבקבוקון.
טכניקה זו יכולה לשמש כדי ללמוד את ההשפעות של הפחתת קולטני ionotropic מעכבות metabotropic בגוף פטריות קומפלקס מרכזי על התנהגות דבורה דבש.
