初めて、成人ミツバチの脳のニューロンのサブセットに、ヨノトロピックGABAAおよび代謝性グルタミン酸受容体用にコード化された遺伝子の改変を確立しました。CRISPR-Cas9遺伝子編集は、成人の脳内の1つまたは複数の遺伝子を改変し、制御された実験室の条件下での学習と記憶における役割を探求するために使用することができる。この方法は、成虫ミツバチの特定のタンパク質の機能を研究し、また、対応するタンパク質に対する抗体の特異性を試験するために使用することができる。
イリーナ・シナケヴィッチとの手順を実証するのは、私の研究室の元学部生であるレフ・カーツマンとヒョン・チョイです。CRISPR-Cas9注射後の免疫細胞化学分析によりRDLおよびmGlutR1の発現を試験するには、まず、オンラインCRISPR-Cas9ツールを使用して、apis mellifera、RDL、およびmGlutR1のガイドDNA配列を使用してガイドを設計します。各ガイドRNAに対してガイドRNA複合体形成を作成し、ガイドRNAの名前を持つ各ガイドに1つの試験管をラベル付けし、ヌクレオチドフリーバッファーの92マイクロリットル、100マイクロモルフルオロフォアの4マイクロリットル、CRISPR RNAの標識されたトランスアクティベートCRISPR RNA、および各チューブに適切なガイドRNA溶液の4マイクロリットルを加えます。
すべての材料が追加されたら、溶液を穏やかに混合し、ベンチトップ遠心分離機でチューブの内容物を5秒間回転させ、溶液を沈下させます。その後、溶液を摂氏95度に5分間保ち、ガイドRNA複合体を作成し、続いて室温で10分間冷却します。リボヌクレオタンパク質複合体形成を調製するために、各ガイドRNA溶液の6マイクロリットルおよび6マイクロリットルをマイクロリットルSP-Cas9ヌクレアーゼV3に適切に標識されたチューブに加える。
穏やかな混合の後、溶液を摂氏37度で10分間インキュベートし、RNPリボヌクレオタンパク質混合物を注射用に作り、インキュベーションの最後に各リボヌクレオタンパク質の4マイクロリットルを適切なRDLに加える。対照を作るために、ノーガイドRNA溶液は、トレーサーRNAの4マイクロリットルと92マイクロリットルのバッファと4マイクロリットルの水を混合します。水を加えた後、溶液を摂氏95度で5分間保ち、室温に達するまで冷まします。
次に、6マイクロリットルの無誘導RNA溶液を、マイクロリットルCas9ヌクレアーゼV3あたり0.5マイクログラムの6マイクロリットルと混合します。リボヌクレオプロテイン混合物注射の場合、キャップに小さな穴を開けてバイアルに個々のミツバチを捕獲した後、氷の上で3分以上ミツバチを固定し、各ミツバチをダクトテープで以前に準備した金属ホルダーに固定します。後胸郭、翼と頭が露出しています。5ミリリットルの注射器を使用して、空腹でなくなるまで1つの臼歯スクロース溶液でミツバチに餌を与え、湿ったペーパータオルを入れた箱に入れて湿度を確保します。
次に、2つの35ミリリットルのシャーレの蓋の内側にワックスを置き、皿の底をワックスの上に置きます。各皿のカバーと底の間に1つの大臼歯のスクロースを注入し、1つの供給シャーレを1つのガラススライドで白い箱に入れ、もう一方を1つのガラススライドで黒い箱に入れます。次に、小さな櫛を各ボックスに入れ、RDL CRISPR-Cas9混合物でマイクロインジェクションシステムをロードします。
RDL CRISPR-Cas9注射の場合、リボヌクレオプロテインRDLミックスの345ナノリットルを持つ8匹のミツバチの中央値オセリを注入し、続いて1つの臼歯スクロースを供給してから、ミツバチを黒い実験箱に放出します。注射を行わずに 8 個のミツバチの 2 番目のセットをコントロールとしてフィードし、白いコントロール ボックスに放します。その後、両方の箱を湿った紙でポリスチレン容器に入れ、ミツバチを1日2回観察して、十分な食料と良好な湿度を確保します。
注射の48時間後、氷の上でミツバチを30秒間固定し、ハサミを使って各昆虫を切断する。ヘッドを発煙フードの解剖顕微鏡下でPBSの4%パラホルムアルデヒドに入れ、バラカーアイリスはさみを使用して、触角、複合眼、および上部外骨格を慎重に迅速に取り除きます。頭部を固定溶液に10分間座ってから、残りのexo骨格を頭部と残りの気管から取り除きます。
次に、4%パラホルムアルデヒドの少なくとも1ミリリットルを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に各脳を摂氏4〜8度で一晩置く。翌朝、3.8グラムのアルクロースをエルレンマイヤーフラスコの蒸留水50ミリリットルに加え、アルクロースが液化するまで溶液をマイクロ波に入れます。3〜4個の固定ミツバチの脳を新しい35ミリメートルのシャーレに移し、ティッシュペーパーを使って過剰な固定剤を取り除きます。
慎重に脳の上に液体のアルクロースを注ぎ、アンテナローブが上向きになるようにargrose内のサンプルを向けます。アルクロースが固まった後、メスを使用して単一の脳を含むアルクロースの個々のブロックを切り取り、1つのバスケットに疎水性メッシュボトムと600マイクロリットルのPBSを積んだ24ウェルプレートの各ウェルを充填します。次いで、ビブラートオームを用いて、各アルゴローズブロックから脳組織の70マイクロメートルの断面を取得する。
単一の脳から取得された同じバスケットのメッシュ上にセクションを配置します。標準的なプロトコルに従って、フルオロフォア共役抗体でセクションを標識した後、取り付け媒体の滴を使用して単一の脳からのセクションで各スライドを埋め込み、蛍光顕微鏡でサンプルを視覚化する。抗RDLは野生型の前頭セクションに神経ピルを標識しますが、CRISPR-Cas9 RDLノックアウトビー脳ではありません。
抗mGlutR1抗体に対して同様の特異性が認められた。これらの代表的な、定量PCRは、RDL CRIPSR-Cas9を注入したミツバチの脳における試験を滴下し、蛍光の相対的な減少は、サンプル中の修飾されたガイドDNAの数に対応した。mGlutR1 CRISPR-Cas9注射後、非注射ミツバチの脳で観察されたガイドDNAと比較して、ガイドDNAの相対修飾は、注射されたミツバチの脳で約59%であった。
この定量的RT-PCRは、メッセンジャーRNA RDLの相対的な減少は、非注入ミツバチ中のRNAのレベルと比較して約59%であり、注入されたミツバチにおけるメッセンジャーmGlutR1 RNAの相対的な減少は約53%顕著であったが、オセリを介したRDL CRISPR-Cas9の注入は必ずしも多数の脳細胞に達するとは限らない。例えば、これらの製剤では、他のハチの脳と比較して多数の脳細胞においてRDL CRISPR-Cas9を持っていたのは8人中1人だけだった。RDL CRISPR-Cas9は原始セレブラムの細胞内に集中していますが、アンテナローブは濃縮されていません。
RNAの凍結や再凍結は避けてください。ミツバチを過度に冷やさないでバイアル内の移動を停止したら、すぐにそれらを利用してください。
この技術は、ミツバチの行動に対するキノコおよび中央複合体における阻害性外向性および代謝性受容体の減少の影響を研究するために使用することができる。
