Pour la première fois, nous avons établi une modification des gènes codés pour gabaa ionotropique et récepteurs de glutamate metabotropic dans les sous-ensembles de neurones dans le cerveau adulte abeille mellifeutique. L’édition des gènes CRISPR-Cas9 peut être utilisée pour modifier un ou plusieurs gènes dans le cerveau des abeilles adultes afin d’explorer leur rôle dans l’apprentissage et la mémoire dans des conditions de laboratoire contrôlées. Cette méthode peut être utilisée pour étudier la fonction de protéines spécifiques chez les abeilles adultes, ainsi que pour tester la spécificité des anticorps contre leurs protéines correspondantes.
Lev Kurtzman et Hyun Choi, anciens étudiants de premier cycle de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure avec Irina Sinakevitch. Pour tester l’expression de RDL et mGlutR1 par analyse immunocytochimique après l’injection CRISPR-Cas9, d’abord, utilisez un outil CRISPR-Cas9 en ligne pour concevoir les guides à l’aide de la séquence d’ADN guide d’apis mellifera, RDL et mGlutR1. Pour préparer les formations complexes d’ARN guide pour chaque ARN guide, étiquetez un tube à essai pour chaque guide avec le nom de l’ARN guide, et ajoutez 92 microlitres de tampon sans nucléotide, quatre microlitres de 100 fluorophore micromolaire, étiquetés transactivant l’ARN CRISPR, et quatre microlitres de la solution d’ARN guide appropriée à chaque tube.
Lorsque tous les matériaux ont été ajoutés, mélanger les solutions doucement et faire tourner le contenu du tube dans une centrifugeuse de banc pendant cinq secondes pour sédimenter la solution. Ensuite, gardez les solutions à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour créer un complexe d’ARN guide suivi d’un refroidissement de 10 minutes à température ambiante. Pour préparer les formations complexes de ribonucléoprotéine ajouter six microlitres de chaque solution d’ARN de guide et six microlitres de 0,5 microgrammes par microlitre SP-Cas9 nucléase V3 aux tubes correctement étiquetés.
Après un mélange doux, incuber les solutions à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes Pour faire des mélanges de ribonucléoprotéine RNP pour injection, à la fin de l’incubation ajouter quatre microlitres de chaque ribonucléoprotéine à la RDL appropriée. Pour effectuer un contrôle, la solution ARN sans guide mélange quatre microlitres d’ARN traceur avec 92 microlitres de tampon et quatre microlitres d’eau. Après l’ajout d’eau, garder la solution pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius et laisser refroidir le mélange jusqu’à ce qu’il atteigne la température ambiante.
Ensuite, mélangez six microlitres de la solution arn sans guide avec six microlitres de 0,5 microgramme par microlitre Cas9 nucléase V3. Pour l’injection de mélange de ribonucléoprotéines, après avoir capturé des abeilles individuelles dans des flacons avec un petit trou dans les bouchons, immobiliser les abeilles pendant pas plus de trois minutes sur la glace et fixer chaque abeille dans des supports métalliques préalablement préparés avec du ruban adhésif. Avec le thorax arrière, les ailes et la tête exposées. Utilisez une seringue de cinq millilitres pour nourrir les abeilles avec une solution de saccharose molaire jusqu’à ce qu’elles n’ont plus faim, et placez les abeilles sécurisées dans une boîte avec une serviette en papier humide pour l’humidité.
Ensuite, placez de la cire à l’intérieur des couvercles de deux boîtes de Pétri de 35 millilitres et placez le fond des plats sur la cire. Injectez un saccharose molaire entre le couvercle et le fond de chaque plat, et placez une boîte de Pétri d’alimentation dans la boîte blanche avec une glissière en verre et placez l’autre dans la boîte noire avec une glissière en verre. Ensuite, placez un petit peigne dans chaque boîte et chargez un système de microinjection avec le mélange RDL CRISPR-Cas9.
Pour l’injection RDL CRISPR-Cas9, injecter les ocelli médianes de huit abeilles avec 345 nanolitres de ribonucléoprotéine RDL mélange suivi de l’alimentation avec un saccharose molaire avant de libérer les abeilles dans la boîte expérimentale noire. Nourrissez un deuxième ensemble de huit abeilles sous forme de commandes sans injections et relâchez-les dans la boîte de contrôle blanche. Ensuite, placez les deux boîtes dans un récipient en polystyrène avec du papier humide, en observant les abeilles deux fois par jour pour s’assurer qu’elles ont suffisamment de nourriture et une bonne humidité.
48 heures après l’injection, immobiliser les abeilles sur la glace pendant 30 secondes et utiliser des ciseaux pour décapiter chaque insecte. Placez les têtes dans le paraformaldéhyde de 4% dans PBS sous un microscope disséquant dans un capot de fumée, et utilisez des ciseaux d’iris barraquer pour enlever soigneusement mais rapidement les antennes, les yeux composés, et l’exosquelette supérieur. Laissez les têtes s’asseoir dans la solution fixative pendant 10 minutes avant d’enlever le reste du squelette exo de la tête et toute la trachée restante.
Ensuite, placez chaque cerveau dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant au moins un millilitre de 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit à quatre à huit degrés Celsius. Le lendemain matin, ajouter 3,8 grammes d’argrose à 50 millilitres d’eau distillée dans un flacon erlenmeyer et cuire au micro-ondes la solution jusqu’à ce que l’argrose liquéfie. Transférer trois à quatre cerveaux fixes d’abeilles mellifeuaux dans une nouvelle boîte de Pétri de 35 millimètres et utiliser du papier de soie pour éliminer l’excès fixatif.
Versez soigneusement l’argrose liquide sur le cerveau et orientez les échantillons dans l’argrose de sorte que les lobes des antennes soient orientés vers le haut. Une fois que l’argrose s’est solidifiée, utilisez un scalpel pour découper des blocs individuels d’argrose contenant un seul cerveau et remplir chaque puits d’une plaque de 24 puits chargée d’un panier avec un fond de maille hydrophobe et 600 microlitres de PBS par puits. Ensuite, utilisez un vibratome pour acquérir des sections transversales de 70 micromètres du tissu cérébral à partir de chaque bloc argrose.
Placer les sections d’un seul cerveau sur la maille du même panier qu’elles sont acquises. Après avoir étiqueté les sections avec des anticorps conjugués au fluorophore, selon les protocoles standard, intégrer chaque diapositive avec des sections d’un seul cerveau à l’aide d’une goutte de milieu de montage et visualiser les échantillons par microscopie de fluorescence. Anti-RDL étiquettes neuropils dans la section frontale de type sauvage, mais pas CRISPR-Cas9 RDL knockout cerveaux d’abeille.
Une spécificité similaire a été observée pour les anticorps anti-mGlutR1. Dans ces tests de chute de PCR quantitatifs dans les cerveaux d’abeilles injectés avec RDL CRIPSR-Cas9, la réduction relative de la fluorésence correspondait au nombre de l’ADN guide modifié dans l’échantillon. Après l’injection de CRISPR-Cas9 mGlutR1, la modification relative de l’ADN du guide était d’environ 59 % dans le cerveau des abeilles injectées par rapport à l’ADN guide observé dans le cerveau des abeilles non injectées.
Dans ce groupe quantitatif rt-PCR ina distinct d’abeilles, la réduction relative de l’ARN rdl d’ARN messager était approximativement 59% comparée au niveau d’ARN dans les abeilles non injectées, et la réduction relative de l’ARN mGlutR1 messager dans les abeilles injectées était approximativement 53%Notamment, l’injection de RDL CRISPR-Cas9 par l’ocelli pourrait ne pas toujours atteindre un grand nombre de cellules de cerveau. Par exemple, dans ces préparations, seulement un être sur huit avait RDL CRISPR-Cas9 dans un grand nombre de cellules cérébrales par rapport à d’autres cerveaux d’abeille. Avec le RDL CRISPR-Cas9 concentré dans les cellules du protocerebrum, mais pas le lobe antennel.
Assurez-vous d’éviter l’ARN congelé et recongelé. Prenez soin de ne pas trop rééquiper les abeilles. Harnais-les immédiatement une fois que l’arrêt se déplace dans le flacon.
Cette technique peut être utilisée pour étudier les effets de la réduction des récepteurs ionotropiques et metabotropes inhibiteurs dans le corps des champignons et le complexe central sur le comportement des abeilles mellifères.
