Pela primeira vez estabelecemos uma modificação dos genes codificados para receptores de gabaa ionotrópicos e receptores de glutamato metabotrópicos em subconjuntos de neurônios no cérebro adulto de abelhas. A edição de genes CRISPR-Cas9 pode ser usada para modificar um ou múltiplos genes em cérebros de abelhas adultas para explorar seus papéis no aprendizado e na memória sob condições de laboratório controladas. Este método pode ser usado para estudar a função de proteínas específicas em abelhas adultas, bem como para testar a especificidade dos anticorpos contra suas proteínas correspondentes.
Demonstrando o procedimento com Irina Sinakevitch estarão Lev Kurtzman e Hyun Choi, ex-alunos do meu laboratório. Para testar a expressão de RDL e mGlutR1 por meio da análise imunocitoquímica após a injeção crispr-cas9, primeiro, use uma ferramenta CRISPR-Cas9 on-line para projetar os guias usando a sequência de DNA guia de apis mellifera, RDL e mGlutR1. Para preparar as formações complexas de RNA guia para cada RNA guia, rotule um tubo de ensaio para cada guia com o nome do RNA guia e adicione 92 microliters de tampão sem nucleotídeos, quatro microlitadores de 100 fluoróforos de micromolar, rotulados de RNA CRISPR transativando e quatro microliters da solução RNA guia apropriada para cada tubo.
Quando todos os materiais tiverem sido adicionados, misture as soluções suavemente e gire o conteúdo do tubo em uma centrífuga de bancada por cinco segundos para sedimentar a solução. Em seguida, mantenha as soluções a 95 graus Celsius por cinco minutos para criar um complexo de RNA guia seguido de 10 minutos de resfriamento à temperatura ambiente. Para preparar as formações complexas de ribonucleoproteína, adicione seis microlitadores de cada solução guia RNA e seis microliters de 0,5 microgramas por microliter SP-Cas9 nuclease V3 aos tubos devidamente rotulados.
Após a mistura suave, incubar as soluções a 37 graus Celsius por 10 minutos Para fazer misturas de ribonucleoproteína RNP para injeção, no final da incubação adicione quatro microlitradores de cada ribonucleoproteína ao RDL apropriado. Para fazer um controle, a solução RNA sem guias mistura quatro microliters de RNA rastreador com 92 microliters de buffer e quatro microliters de água. Após a adição de água, mantenha a solução por cinco minutos a 95 graus Celsius e deixe a mistura esfriar até atingir a temperatura ambiente.
Em seguida, misture seis microlitadores da solução RNA sem guia com seis microlitadores de 0,5 microgramas por microliter Cas9 nuclease V3. Para injeção de mistura de ribonucleoproteína, depois de capturar abelhas individuais em frascos com um pequeno orifício nas tampas, imobilizar as abelhas por não mais do que três minutos no gelo e fixar cada abelha em suportes metálicos previamente preparados com fita adesiva. Com o tórax traseiro, asas e a cabeça expostas. Use uma seringa de cinco mililitros para alimentar as abelhas com uma solução de sacarose molar até que elas não estejam mais com fome, e coloque as abelhas presas em uma caixa com uma toalha de papel molhada para umidade.
Em seguida, coloque cera no interior das tampas de duas placas de petri de 35 mililitros e coloque os fundos das placas sobre a cera. Injete uma sacarose molar entre a tampa e o fundo de cada prato, e coloque uma placa de petri de alimentação na caixa branca com um escorregador de vidro e coloque a outra na caixa preta com um escorregador de vidro. Em seguida, coloque um pequeno pente em cada caixa e carregue um sistema de microinjeção com a mistura RDL CRISPR-Cas9.
Para injeção RDL CRISPR-Cas9, injete o ocelli mediano de oito abelhas com 345 nanoliters de mistura RDL de ribonucleoproteína seguida de alimentação com uma sacarose molar antes de liberar as abelhas na caixa experimental preta. Alimente um segundo conjunto de oito abelhas como controles sem quaisquer injeções e solte-as na caixa de controle branca. Em seguida, coloque ambas as caixas em um recipiente de poliestireno com papel molhado, observando as abelhas duas vezes ao dia para garantir que elas tenham comida suficiente e uma boa umidade.
48 horas após a injeção, imobilize as abelhas no gelo por 30 segundos e use uma tesoura para decapitar cada inseto. Coloque as cabeças em 4% de paraformaldeído IN PBS sob um microscópio dissecando em um capô de fumaça, e use uma tesoura de íris barraquer para remover cuidadosamente, mas rapidamente, as antenas, os olhos compostos e o exoesqueleto superior. Deixe as cabeças sentarem-se na solução fixada por 10 minutos antes de remover o resto do esqueleto exo da cabeça e de toda a traqueia restante.
Em seguida, coloque cada cérebro em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo pelo menos um mililitro de 4% de paraformaldeído durante a noite a quatro a oito graus Celsius. Na manhã seguinte, adicione 3,8 gramas de argrose a 50 mililitros de água destilada em um frasco erlenmeyer e micro-ondas a solução até que a argrose liquifies. Transfira de três a quatro cérebros fixos de abelhas fixas em uma nova placa de petri de 35 milímetros e use papel de tecido para remover o excesso de fixação.
Despeje cuidadosamente o líquido sobre o cérebro e oriente as amostras dentro da argrose para que os lobos das antenas estejam voltados para cima. Depois que a argrose se solidificar, use um bisturi para cortar blocos individuais de argrose contendo um único cérebro e encher cada poço de uma placa de 24 poços carregada com uma cesta com um fundo de malha hidrofóbica e 600 microlitres de PBS por poço. Em seguida, use um vibratome para adquirir seções transversais de 70 micrômetros do tecido cerebral de cada bloco de argrose.
Colocando as seções de um único cérebro na malha da mesma cesta que são adquiridas. Depois de rotular as seções com anticorpos conjugados fluoróforos, de acordo com os protocolos padrão, incorpore cada slide com seções de um único cérebro usando uma gota de meio de montagem e visualize as amostras por microscopia de fluorescência. Anti-RDL rotula neuropils na seção frontal do tipo selvagem, mas não crispr-Cas9 RDL cérebros de abelhas knockout.
Observou-se especificidade semelhante para anticorpos anti-mGlutR1. Nestes representantes, os testes quantitativos de PCR em cérebros de abelhas injetados com RDL CRIPSR-Cas9, a redução relativa da fluoresência correspondeu ao número do DNA guia modificado na amostra. Após a injeção de mGlutR1 CRISPR-Cas9, a modificação relativa do DNA guia foi de aproximadamente 59% no cérebro de abelhas injetadas em comparação com o DNA guia observado no cérebro de abelhas não injetadas.
Neste grupo quantitativo de RT-PCR ina separado de abelhas, a redução relativa do RNA RDL mensageiro foi de aproximadamente 59% em comparação com o nível de RNA em abelhas não injetadas, e a redução relativa do mensageiro mGlutR1 RNA em abelhas injetadas foi de aproximadamente 53% Notavelmente, a injeção de RDL CRISPR-Cas9 através do ocelli pode nem sempre atingir um grande número de células cerebrais. Por exemplo, nessas preparações apenas um em cada oito tinha RDL CRISPR-Cas9 em grande número de células cerebrais em comparação com outros cérebros de abelhas. Com o RDL CRISPR-Cas9 concentrado dentro das células do protocerebrum, mas não no lóbulo antenal.
Certifique-se de evitar RNA congelado e refrozen. Tome cuidado para não sobreoxiar as abelhas. Aproveite-os imediatamente assim que a parada parar de se mover no frasco.
Esta técnica pode ser usada para estudar os efeitos da redução de receptores ionotrótrópicos e metabotrópicos inibitórios no corpo do cogumelo e complexo central no comportamento das abelhas.
