Zum ersten Mal haben wir eine Modifikation der Gene für ionotrope GABAA und metabotrope Glutamat-Rezeptoren in Teilmengen von Neuronen im erwachsenen Honigbienengehirn kodiert etabliert. DIE CRISPR-Cas9-Genbearbeitung kann verwendet werden, um ein oder mehrere Gene in erwachsenen Bienengehirnen zu modifizieren, um ihre Rolle beim Lernen und Gedächtnis unter kontrollierten Laborbedingungen zu erforschen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Funktion bestimmter Proteine bei erwachsenen Bienen zu untersuchen und die Spezifität von Antikörpern gegen ihre entsprechenden Proteine zu testen.
Demonstrieren das Verfahren mit Irina Sinakevitch werden Lev Kurtzman und Hyun Choi, ehemalige Studenten aus meinem Labor. Um die Expression von RDL und mGlutR1 durch immunzytochemische Analyse nach CRISPR-Cas9-Injektion zu testen, verwenden Sie zunächst ein Online-Tool CRISPR-Cas9, um die Leitfäden mit der Leit-DNA-Sequenz von apis mellifera, RDL und mGlutR1 zu entwerfen. Um für jede Führungs-RNA eine Führungs-RNA vorzubereiten, beschriften Sie ein Reagenzglas für jede Führungs-RNA mit dem Namen der Guide-RNA und fügen Sie 92 Mikroliter Nukleotid-freien Puffer, vier Mikroliter 100 mikromolares Fluorophor, transaktivierende CRISPR-RNA, und vier Mikroliter der entsprechenden Führungs-RNA-Lösung zu jeder Röhre hinzu.
Wenn alle Materialien hinzugefügt wurden, mischen Sie die Lösungen sanft und drehen Sie den Rohrinhalt in einer Tischzentrifuge für fünf Sekunden, um die Lösung zu sedimentieren. Halten Sie dann die Lösungen fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius, um einen RNA-Führungskomplex zu erstellen, gefolgt von einer 10-minütigen Abkühlung bei Raumtemperatur. Zur Herstellung des Ribonukleoproteins fügen komplexe Formationen sechs Mikroliter jeder Führungs-RNA-Lösung und sechs Mikroliter 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter SP-Cas9-Nuklease V3 in die entsprechend gekennzeichneten Röhrchen ein.
Nach sanftem Mischen die Lösungen bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren Um RNP-Ribonukleoprotein-Mischungen zur Injektion herzustellen, fügen Sie am Ende der Inkubation vier Mikroliter jedes Ribonukleoproteins in die entsprechende RDL ein. Um eine Kontrolle zu ermöglichen, mischen Sie eine no-guide RNA-Lösung vier Mikroliter Tracer-RNA mit 92 Mikroliter Puffer und vier Mikroliter Wasser. Nach dem Zusatz von Wasser, halten Sie die Lösung für fünf Minuten bei 95 Grad Celsius und lassen Sie die Mischung abkühlen, bis sie Raumtemperatur erreicht.
Mischen Sie dann sechs Mikroliter der NO-Guide-RNA-Lösung mit sechs Mikrolitern von 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter Cas9 Nuklease V3. Bei der Ribonukleoprotein-Mischungsinjektion, nach der Erfassung einzelner Bienen in Fläschchen mit einem kleinen Loch in den Kappen, die Bienen nicht mehr als drei Minuten auf Eis immobilisieren und jede Bee in zuvor hergestellten Metallhaltern mit Klebeband sichern. Mit dem Rücken Thorax, Flügel und Kopf ausgesetzt. Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze, um die Bienen mit einer einmolaren Saccharoselösung zu füttern, bis sie nicht mehr hungrig sind, und legen Sie die gesicherten Bienen in eine Schachtel mit einem nassen Papiertuch für Feuchtigkeit.
Als nächstes legen Sie Wachs auf die Innenseite der Deckel von zwei 35 Milliliter Petrischalen und legen Sie die Böden der Gerichte auf das Wachs. Injizieren Sie eine MolarSaccharose zwischen der Abdeckung und dem Boden jeder Schale, und legen Sie eine Fütterung Petrischale in eine weiße Box mit einer Glasrutsche und legen Sie die andere in eine schwarze Box mit einer Glasrutsche. Legen Sie dann einen kleinen Kamm in jede Box und laden Sie ein Mikroinjektionssystem mit dem RDL CRISPR-Cas9-Gemisch.
Bei der RDL CRISPR-Cas9-Injektion den Median-Ocelli von acht Bienen mit 345 NanoliterN Ribonukleoprotein-RDL-Mix injizieren, gefolgt von der Fütterung mit einer Molarensaccharsarose, bevor die Bienen in die schwarze Versuchsbox freigesetzt werden. Füttern Sie einen zweiten Satz von acht Bienen als Steuerung ohne Injektionen und lassen Sie sie in die weiße Steuerbox. Legen Sie dann beide Kisten in einen Polystyrolbehälter mit nassem Papier und beobachten Sie die Bienen zweimal täglich, um sicherzustellen, dass sie genügend Nahrung und eine gute Luftfeuchtigkeit haben.
48 Stunden nach der Injektion, immobilisieren Sie die Bienen auf Eis für 30 Sekunden und verwenden Sie eine Schere, um jedes Insekt zu enthaupten. Legen Sie die Köpfe in 4%Paraformaldehyd IN PBS unter einem Sezierendes Mikroskop in einer Dunstabzugshaube und verwenden Sie barraquer IrisSchere, um die Antennen, zusammengesetzten Augen und das obere Exoskelett sorgfältig, aber schnell zu entfernen. Lassen Sie die Köpfe 10 Minuten in der fixativen Lösung sitzen, bevor Sie den Rest des Exo-Skeletts vom Kopf und die gesamte verbleibende Luftröhre entfernen.
Dann legen Sie jedes Gehirn in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr, das mindestens einen Milliliter 4% Paraformaldehyd über Nacht bei vier bis acht Grad Celsius enthält. Am nächsten Morgen 3,8 Gramm Argrose zu 50 Milliliter destilliertem Wasser in einem Erlenmeyerkolben und Mikrowelle nieren, bis die Argbrose liiert. Übertragen Sie drei bis vier feste Honigbienengehirne in eine neue 35-Millimeter-Petrischale und verwenden Sie Tissuepapier, um die überschüssige Fixierung zu entfernen.
Gießen Sie die flüssige Argrose vorsichtig über das Gehirn und orientieren Sie die Proben innerhalb der Argrose so, dass die Antennenlappen nach oben gerichtet sind. Nachdem die Argrose verfestigt hat, verwenden Sie ein Skalpell, um einzelne Blöcke von Argrose mit einem einzigen Gehirn auszuschneiden und füllen Sie jeden Brunnen einer 24-Well-Platte mit einem Korb mit einem hydrophoben Netzboden und 600 Mikroliter PBS pro Brunnen geladen. Verwenden Sie dann ein Vibratome, um 70 Mikrometer Querschnitte des Hirngewebes aus jedem Argrosenblock zu erwerben.
Platzieren der Abschnitte von einem einzelnen Gehirn auf das Netz desselben Korbes, wie sie erworben werden. Nach der Kennzeichnung der Abschnitte mit fluorophorkonjugierten Antikörpern, nach Standardprotokollen, betten Sie jedes Dia mit Abschnitten aus einem einzigen Gehirn mit einem Tropfen Montagemedium ein und visualisieren die Proben durch Fluoreszenzmikroskopie. Anti-RDL kennzeichnet Neuropils im frontalen Bereich des Wildtyps, aber nicht CRISPR-Cas9 RDL Knockout Bienengehirne.
Eine ähnliche Spezifität wurde bei Anti-MGlutR1-Antikörpern beobachtet. In diesen repräsentativen, quantitativen PCR-Drop-off-Tests in Bienengehirnen, die mit RDL CRIPSR-Cas9 injiziert wurden, entsprach die relative Reduktion der Fluoresenz der Anzahl der modifizierten Führungs-DNA in der Probe. Nach der mGlutR1 CRISPR-Cas9-Injektion betrug die relative Modifikation der Führungs-DNA im Gehirn der injizierten Bienen etwa 59 % im Vergleich zur Führungs-DNA, die im Gehirn von nicht injizierten Bienen beobachtet wurde.
In dieser quantitativen RT-PCR-Ina-Gruppe von Bienen betrug die relative Reduktion der Boten-RNA RDL etwa 59% im Vergleich zum RNA-Niveau bei nicht injizierten Bienen, und die relative Reduktion der Botenstoff-mGlutR1-RNA bei injizierten Bienen betrug etwa 53%. Zum Beispiel hatte bei diesen Präparaten nur einer von acht RDL CRISPR-Cas9 in einer großen Anzahl von Gehirnzellen im Vergleich zu anderen Bienengehirnen. Mit dem RDL CRISPR-Cas9 konzentriert in den Zellen des Protocerebrum, aber nicht der Antennenlappen.
Achten Sie darauf, gefrorene und eingefrorene RNA zu vermeiden. Achten Sie darauf, die Bienen nicht zu überkühlen. Nutze sie sofort, sobald sich der Stopp in der Durchstechflasche bewegt.
Diese Technik kann verwendet werden, um die Auswirkungen der Reduktion von hemmenden ionotropen und metabotropen Rezeptoren im Pilzkörper und zentralen Komplex auf das Verhalten der Honigbiene zu studieren.
