通过低温BN-MS分析进行高分辨率复杂分析

csBN-MS技术的发展中心目标是全面获得蛋白质复合物的组织和组装，这些复合物是各种组织和器官的血浆膜上和整个血浆膜信号转导基础。csBN-MS 目前为分析原生蛋白质复合物及其亚基组成提供了最高分辨率的多功能性，尤其是膜蛋白。虽然csBN-MS技术是开发来分析啮齿动物大脑中膜蛋白组件的复杂混合物，但它可以很容易地适应任何类型的生物样本的分析。

我们方法的关键步骤之一是嵌入凝胶片及其在切片前与切割平面的正确对齐。注意不要撕裂或压缩凝胶，并确保凝胶没有倾斜到切割平面，因为这将降低分析的分辨率。我们的 csBN-MS 技术有几个实际步骤，对于良好的效果至关重要。

与仅仅描述这些步骤时，展示如何详细执行这些步骤要容易得多。要开始此过程，请使用由泵驱动的搅拌双腔梯度混合器铸造线性或双曲孔梯度凝胶。准备前混合室和储层室的解决方案，如文本协议中所述。

启动搅拌器，将 30 微升 APS 和 2.5 微升 TEMED 添加到前室的溶液中。然后，启动泵并打开前阀。大约一分钟后，将 90 微升 APS 和 5 微升 TEMED 添加到储层室，然后打开腔室连接。

让凝胶在室温下缓慢而彻底地聚合至少 24 小时，产生均匀的孔径梯度。如果保持湿润，聚合凝胶可以在四摄氏度下直立储存长达一周。接下来，在玻璃板之间插入适当的空间来准备加载槽，以分离 0.5 到 2.0 毫克的蛋白质。

插槽应至少三厘米宽。对于运行缓冲器，准备一个常立阴极缓冲器，包括 50 毫摩尔三辛、50 毫摩尔双子数和 0.01% Coomassie G-250。准备一个由50毫摩尔双三组成的标准阳极缓冲器。

在冰上溶解约2.5毫克膜和两毫升含有1%非变性洗涤剂的溶解缓冲液30分钟。然后在13万次G的超离心11分钟。将溶解液集中在短的50%20%蔗糖步进梯度上，在40万次G下超离心，一小时。

在此之后，从管底收获蔗糖梯度，在溶解度中加入0.05%的库马西G-250，并将样品加载到凝胶上。使用三步电压协议在 10 摄氏度下运行准备 BN-PAGE，如文本协议中所述。凝胶运行后扫描凝胶以进行记录，同时在玻璃板之间保留。

检查凝胶分离的质量。接下来，将盘子分开，并切除感兴趣的车道部分。用30%乙醇和15%醋酸修复车道两次，至少30分钟。

转移嵌入介质的样品，并允许其浸泡和平衡至少两个小时，同时保持凝胶板在轨道摇床上的慢动作。然后，将固定的凝胶通道切成与蛋白质迁移前或带状模式完全平行的部分。将每个部分放在尺寸相等的塑料薄膜支撑上，以便于操作。

将通道转移到一个打开的管中，其塞子在底部关闭，在顶部集中穿孔，均与凝胶部分的上端和下端精确对齐。将油缸短暂浸入液氮中，快速启动凝固。透明嵌入介质在几秒钟内凝固，并在颜色上变为白色。

用嵌入介质填充腔腔，将油缸短暂地浸入液氮中，然后让它在零下20摄氏度下彻底冻结数小时。拆卸后，拆下塑料薄膜，将带嵌入式凝胶部分的块转移到冷却的金属缸中。气缸直径较大，外层密封，带嵌入介质。

它被放置在一个平面支撑上。如上所述，用嵌入介质填充气缸并彻底冻结。对气缸的另一侧重复此过程，以获得具有共平面底部表面的实心块。

然后，从气缸中取出缸体，并使用嵌入介质将其粘附到预冷却的金属支架上。将金属支架插入冷冻机。支架必须仔细对齐与切片平面。

让块平衡到切片过程的最佳温度。收获后，凝胶一个又一个切片，最终所需的厚度为0.25毫米的步长，并分别转移到低蛋白结合特性的反应管。然后，对切片进行试消化和质谱分析。

该协议将高分辨率复数组分析的应用扩展到表达低丰蛋白的非线粒体膜。复杂的分离显示强烈染色的蛋白质带，迁移伪影很少。肽信号在质量和保留时间上的偏差表明假阳性峰值体积分配的速率非常低。

通过重新缩放峰值卷数据集，可以轻松消除运行到运行的变化。然后使用由此产生的肽强度信息重建2545个相对丰度蛋白质轮廓。通过连接相邻切片的数据集，评估了凝胶采样步数与蛋白质复合物分辨率的相关性。

在 0 . 25 毫米时， TPC1 相关复群的大小分离与西方印迹分析的结果非常一致。两个多片的加入废除了对TPC1复杂亚人口的歧视。最后，分析提供了具有良好特征的复合体信息，并论证了新型子单元和复杂装配体的存在。

对于铁蛋白，根据相对丰度调整的亚单位剖面表明存在至少三种具有明显重/轻链的复合等构体。相比之下，尼卡林-诺莫1复合物、伽马-秘密酶核心复合物和GPI-转酰胺机械显示其核心亚基在整个尺寸范围内的固定丰度比，并且独立于与其他蛋白质的关联。csBN-MS分析的关键参数是复合物的有效分辨率，由样品生物化学、BN凝胶质量、嵌入和切片过程中的正确对齐以及采集的MS数据的质量决定。

将 csBN-MS 与蛋白质和样品的同位素标记组合在一起，可直接比较不同病理生理、生物或发育状态的复杂体。csBN-MS在啮齿动物大脑的膜上进行，揭示了受体、离子通道和传输器在亚单位组成和功能方面的巨大多样性，并且将有助于分析本地制剂中的3D结构。