هذه الطريقة تسمح بطريقة أكثر فعالية لتحديد كمية نشاط الكيتينز في العينات البيولوجية. وقد ثبت أن نشاط Chitinase بمثابة علامة جيدة للتشخيص والفعالية العلاجية في العديد من الظروف والأمراض. كانت الطرق السابقة لقياس نشاط الشيتينز تستغرق وقتًا طويلاً وغالبًا ما يصعب تنفيذها ، وكلاهما من المشاكل التي تم حلها من خلال الفحص الموضح هنا.
هذه التقنية سوف تساعد على تحقيق الكيتيناس المحتملة لديها كعلامة التشخيص والعلاج من خلال جعل من السهل قياس نشاط الشيتيناز؛ على سبيل المثال، يمكن استخدامه لرصد علاج مرض غوشر لأنه ثبت أن نشاط الشيتيناز ينخفض أثناء العلاج الفعال. تبدأ من خلال إعداد ركائز، والمعايير، والحلول للتشكيل. إعداد 1x McIlvain العازلة وفقا لاتجاهات المخطوطة واستخدامها لتخفيف ركائز الكيتين إلى 500 ميكرومولار لكل من.
حل 4-ميثيلوميبيليفرون, المعيار, إلى تركيز 0.1 ميليمولار في توقف العازلة لإنشاء حل الأسهم منحنى القياسية. لكل 10 عينات، مزيج 2.17 ملليلتر من 1x McIlvain العازلة مع 100 ميكرولترات من الركيزة كيتين لخلق حل العمل، ثم ماص 95 ميكرولترات من حل العمل في كل بئر من لوحة 96 جيدا. إضافة خمسة ميكرولترات من عينة الاختبار إلى كل بئر ومزجها في حل العمل.
غطي الطبق واهزه لمدة خمس ثوان، ثم يحضن الصفيحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح بانغام التفاعل الأنزيمي. وفي الوقت نفسه، تمييع محلول المخزون من 4-ميثيلوميبيليفرون لجعل حل معيار العمل خمسة micromolar وخلق منحنى قياسي من خلال إعداد سلسلة من dilutions وفقا للمخطوطة. تبدأ مع تركيز خمسة ميكرومولار ومزيج كل تخفيف جيدا.
بعد الحضانة، إضافة 200 ميكرولترات من توقف العازلة إلى كل بئر لوقف رد الفعل. أضف 300 ميكروليتر مكررة من كل معيار إلى نفس اللوحة، ثم اقرأ اللوحة بإثارة 360 نانومتر وانبعاث 455 نانومتر. وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لقياس نشاط الشيتيناز في القصبات الهوائية وسائل المصل من النوع البري وشيتوريوسيداسي الإفراط في التعبير عن الفئران المعدلة وراثيا.
تؤكد التشايس أن الإفراط في التعبير عن جين CHIT-1 في الفئران يؤدي إلى زيادة نشاط الشيتينز. واستخدم منحنى قياسي لتحديد الكيتينز استنادا إلى الفلور من العينات. أهم شيء أن نتذكر عند محاولة لأول مرة البروتوكول هو إضافة عينات بأسرع وكفاءة ممكن في حين لا يزال خلط شامل.
عند البدء لأول مرة، قد يكون من المفيد القيام بعدد أقل من العينات لكل تشغيل لضمان الدقة في القياسات، وذلك بسبب فترة حضانة أقصر.
