Этот метод позволяет более эффективный способ количественной оценки активности хитиназы в биологических образцах. Chitinase деятельности было показано, служить хорошим маркером для диагностики и терапевтической эффективности в многочисленных условиях и заболеваний. Более ранние методы измерения активности хитиназы часто ото дня и трудно выполнить, обе проблемы, которые были решены в результате анализа показано здесь.
Этот метод поможет выполнить потенциальные хитины имеют в качестве диагностического и терапевтического маркера, сделав его легче измерить активность хитиназы; например, он может быть использован для мониторинга лечения болезни Гоше, потому что хитиназы активность, как было показано, уменьшается во время эффективного лечения. Начните с подготовки субстратов, стандартов и решений для анализа. Подготовь 1x mcIlvain буфер в соответствии с рукописными направлениями и использовать его для разбавления хитин субстратов до 500 микромолей каждый.
Растворите 4-метилумбеллиферон, стандарт, до концентрации 0,1 миллимолара в стоп-буфере, чтобы создать стандартный раствор кривого запаса. Для каждых 10 образцов, смешайте 2.17 миллилитров буфера 1x McIlvain с 100 микролитров хитин субстрата для создания рабочего решения, а затем пипетки 95 микролитров рабочего решения в каждой колодец 96-хорошо пластины. Добавьте пять микролитров тестового образца к каждой хорошо и смешайте его в рабочем решении.
Накройте пластину и встряхните ее в течение пяти секунд, затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут, чтобы энзиматическая реакция состоялась. Между тем, разбавить фондовый раствор 4-метилумбеллиферон, чтобы сделать пятимимолярный рабочий стандартный раствор и создать стандартную кривую, подготовив серию разбавлений в соответствии с рукописью. Начните с пятимимолярной концентрации и хорошо перемешайте каждое разбавление.
После инкубации добавьте 200 микролитров стоп-буфера к каждому колодец, чтобы остановить реакцию. Добавьте 300-микролитровые дубликаты каждого стандарта к одной и той же пластине, затем прочитайте пластину при возбуждении 360 нанометров и выбросе 455 нанометров. Этот протокол был успешно использован для измерения активности хитиназы в бронхоалвеолярной лаваж и сыворотки жидкости дикого типа и хитотриозидазы чрезмерного выражения трансгенных мышей.
Анализ подтверждает, что переэкспрессия гена CHIT-1 у мышей приводит к повышенной активности хитиназы. Стандартная кривая использовалась для определения хитиназы на основе флуоресценции образцов. Самое главное помнить при первой попытке протокола, чтобы добавить образцы как можно быстрее и эффективнее, а еще тщательно смешивания.
При первом запуске может быть полезно сделать меньше образцов за пробег, чтобы обеспечить точность измерений, из-за более короткого инкубационный период.
