Diese Methode ermöglicht eine effektivere Möglichkeit, die Chitinase-Aktivität in biologischen Proben zu quantifizieren. Chitinase-Aktivität hat sich als ein guter Marker für die Diagnose und therapeutische Wirksamkeit bei zahlreichen Bedingungen und Krankheiten dienen. Frühere Methoden zur Messung der Chitinase-Aktivität waren oft zeitaufwändig und schwierig durchzuführen, beides Probleme, die durch den hier gezeigten Test gelöst wurden.
Diese Technik wird dazu beitragen, die potenziellen Chitinasen als diagnostischen und therapeutischen Marker zu erfüllen, indem sie es einfacher macht, die Chitinase-Aktivität zu messen; zum Beispiel kann es verwendet werden, um die Behandlung der Gaucher-Krankheit zu überwachen, da die Chitinase-Aktivität nachweislich während der effektiven Behandlung abnimmt. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Substraten, Standards und Lösungen für den Assay. Bereiten Sie 1x McIlvain Puffer nach den Manuskriptrichtungen vor und verwenden Sie ihn, um Chitinsubstrate auf jeweils 500 Mikromolar zu verdünnen.
4-Methylumbelliferon, den Standard, auf eine Konzentration von 0,1 Millimolar im Stop-Puffer auflösen, um eine Standard-Kurvenstammlösung zu erstellen. Mischen Sie für 10 Proben 2,17 Milliliter 1x McIlvain-Puffer mit 100 Mikrolitern des Chitinsubstrats, um eine funktionierende Lösung zu schaffen, und pipette dann 95 Mikroliter der Arbeitslösung in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte. Fügen Sie fünf Mikroliter der Testprobe zu jedem Brunnen hinzu und mischen Sie sie in die Arbeitslösung.
Bedecken Sie die Platte und schütteln Sie sie für fünf Sekunden, und bebrüten Sie die Platte dann 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit die enzymatische Reaktion stattfinden kann. In der Zwischenzeit verdünnen Sie die Stammlösung von 4-Methylumbelliferon, um eine Fünf-Mikromolar-Arbeitsstandardlösung zu machen und eine Standardkurve zu erstellen, indem Sie eine Reihe von Verdünnungen nach dem Manuskript vorbereiten. Beginnen Sie mit der Fünf-Mikromolar-Konzentration und mischen Sie jede Verdünnung gut.
Nach der Inkubation 200 Mikroliter Stop-Puffer zu jedem Brunnen hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen. Fügen Sie 300-Mikroliter-Duplikate jedes Standards auf dieselbe Platte, dann lesen Sie die Platte bei einer Anregung von 360 Nanometern und einer Emission von 455 Nanometern. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um die Chitinase-Aktivität in bronchoalveolaren Spülen und Serumflüssigkeit endenden Wilden und Chitotriosidase zu exzierenden transgenen Mäusen zu messen.
Der Test bestätigt, dass eine Überexpression des CHIT-1-Gens bei Mäusen zu einer erhöhten Chitinase-Aktivität führt. Eine Standardkurve wurde verwendet, um Chitinase basierend auf der Fluoreszenz der Proben zu bestimmen. Das Wichtigste, was Sie beim ersten Versuch des Protokolls beachten sollten, ist, die Proben so schnell und effizient wie möglich hinzuzufügen und dabei noch gründlich zu mischen.
Wenn Sie zum ersten Mal beginnen, kann es vorteilhaft sein, weniger Proben pro Durchlauf zu machen, um die Genauigkeit der Messungen zu gewährleisten, aufgrund einer kürzeren Inkubationszeit.
