Este método permite una forma más eficaz de cuantificar la actividad de la chitinasa en muestras biológicas. Se ha demostrado que la actividad chitinasa sirve como un buen marcador para el diagnóstico y la eficacia terapéutica en numerosas condiciones y enfermedades. Los métodos anteriores para la medición de la actividad de la chitinasa eran a menudo lentos y difíciles de realizar, ambos problemas que han sido resueltos por el ensayo que se muestra aquí.
Esta técnica ayudará a cumplir las posibles chitinasas tienen como marcador diagnóstico y terapéutico al facilitar la medición de la actividad de la chitinasa;por ejemplo, se puede utilizar para controlar el tratamiento de la enfermedad de Gaucher porque se ha demostrado que la actividad chitinasa disminuye durante el tratamiento eficaz. Comience preparando sustratos, estándares y soluciones para el ensayo. Prepare 1 tampón de McIlvain de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y utilícelo para diluir sustratos de quitina a 500 micromolares cada uno.
Disolver 4-methylumbelliferone, el estándar, a una concentración de 0,1 milimolar en tampón de parada para crear una solución de stock de curva estándar. Por cada 10 muestras, mezcle 2,17 mililitros de 1x tampón de McIlvain con 100 microlitros del sustrato de quitina para crear una solución de trabajo, luego pipetee 95 microlitros de la solución de trabajo en cada pozo de una placa de 96 pozos. Agregue cinco microlitros de la muestra de prueba a cada pozo y mezcle en la solución de trabajo.
Cubra el plato y agítelo durante cinco segundos, luego incuba la placa a 37 grados Celsius durante 15 minutos para permitir que la reacción enzimática tenga lugar. Mientras tanto, diluir la solución de stock de 4-methylumbelliferone para hacer una solución estándar de trabajo de cinco micromolares y crear una curva estándar mediante la preparación de una serie de diluciones según el manuscrito. Comience con la concentración de cinco micromolares y mezcle bien cada dilución.
Después de la incubación, añadir 200 microlitros de tampón de parada a cada pocóltil para detener la reacción. Añadir duplicados de 300 microlitros de cada estándar a la misma placa, luego leer la placa en una excitación de 360 nanómetros y una emisión de 455 nanómetros. Este protocolo se utilizó con éxito para medir la actividad de la cintinasa en el lavado broncoalveolar y el líquido sérico de tipo salvaje y chitotriosidasa sobre-expresar ratones transgénicos.
El ensayo confirma que la sobreexpresión del gen CHIT-1 en ratones da lugar a un aumento de la actividad de la chitinasa. Se utilizó una curva estándar para determinar la chitinasa basándose en la fluorescencia de las muestras. Lo más importante a recordar al intentar el protocolo por primera vez es agregar las muestras de la forma más rápida y eficiente posible mientras se mezcla a fondo.
Cuando comience, puede ser beneficioso hacer menos muestras por carrera para garantizar la precisión en las mediciones, debido a un período de incubación más corto.
