שיטה זו מאפשרת דרך יעילה יותר לכמת פעילות כיטין בדגימות ביולוגיות. פעילות Chitinase הוכח לשמש סמן טוב לאבחון ויעילות טיפולית בתנאים ומחלות רבות. שיטות קודמות למדידת פעילות chitinase היו לעתים קרובות זמן רב וקשה לבצע, שתי הבעיות נפתרו על ידי ההתמדה המוצגת כאן.
טכניקה זו תסייע להגשים את chitinases הפוטנציאלי יש כסמן אבחון וטיפולי על ידי הפיכת קל יותר למדוד פעילות chitinase;למשל, זה יכול לשמש כדי לפקח על הטיפול במחלת גושה כי פעילות chitinase הוכח לרדת במהלך טיפול יעיל. התחל בהכנת מצעים, תקנים ופתרונות להנחיה. הכן חיץ 1x McIlvain על פי הוראות כתב היד ולהשתמש בו כדי לדלל מצעים כיטין ל 500 micromolar כל אחד.
ממיסים 4-methylumbelliferone, התקן, לריכוז של 0.1 מילימולאר במאגר עצירה כדי ליצור פתרון מלאי עקומה סטנדרטי. עבור כל 10 דגימות, לערבב 2.17 מיליליטר של חיץ McIlvain 1x עם 100 microliters של מצע כיטין כדי ליצור פתרון עובד, ולאחר מכן פיפטה 95 microliters של פתרון העבודה לתוך כל באר של צלחת 96 באר. הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של דגימת הבדיקה לכל באר וערבבו אותה בת פתרון העבודה.
מכסים את הצלחת ומנערים אותה במשך חמש שניות, ואז דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לאפשר את התגובה האנזימטית להתקיים. בינתיים, לדלל את פתרון המלאי של 4-methylumbelliferone כדי להפוך פתרון תקן עבודה חמישה מיקרומולרים וליצור עקומה סטנדרטית על ידי הכנת סדרה של דילולים על פי כתב היד. התחל עם ריכוז של חמישה מיקרומולרים ומערבבים כל דילול היטב.
לאחר הדגירה, להוסיף 200 microliters של חיץ עצירה לכל באר כדי לעצור את התגובה. הוסף כפילויות 300 מיקרוליטר של כל תקן לאותה צלחת, ולאחר מכן לקרוא את הצלחת בגירוי של 360 ננומטר ו פליטה של 455 ננומטר. פרוטוקול זה שימש בהצלחה למדידת פעילות chitinase lavage ברונכואלוולאר ונוזל סרום מסוג פראי ועכברים מהופנטים יתר על המידה.
הבדיקה מאשרת כי לחץ יתר של הגן CHIT-1 בעכברים גורם לפעילות צ'יטינאז מוגברת. עקומה סטנדרטית שימשה כדי לקבוע chitinase מבוסס על פלואורסצנטיות של הדגימות. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת הניסיון הראשון של הפרוטוקול הוא להוסיף את הדגימות במהירות וביעילות האפשרית תוך ערבוב יסודי.
כאשר אתה מתחיל לראשונה, זה עשוי להיות מועיל לעשות פחות דגימות לכל ריצה כדי להבטיח דיוק במדידות, עקב תקופת דגירה קצרה יותר.
