Cette méthode permet un moyen plus efficace de quantifier l’activité de la chitinase dans les échantillons biologiques. L’activité de chitinase s’est montrée pour servir de bon marqueur pour le diagnostic et l’efficacité thérapeutique dans de nombreuses conditions et maladies. Les méthodes antérieures de mesure de l’activité chitinase étaient souvent longues et difficiles à exécuter, deux problèmes qui ont été résolus par l’analyse montrée ici.
Cette technique aidera à réaliser les chitinases potentielles ont comme marqueur diagnostique et thérapeutique en le rendant plus facile à mesurer l’activité de chitinase ; par exemple, il peut être employé pour surveiller le traitement de la maladie de Gaucher parce que l’activité de chitinase a été montrée pour diminuer pendant le traitement efficace. Commencez par préparer des substrats, des normes et des solutions pour l’analyse. Préparez 1x tampon McIlvain selon les instructions manuscrites et utilisez-le pour diluer les substrats de chitine à 500 micromolaires chacun.
Dissoudre le 4-méthylumbelliferone, la norme, à une concentration de 0,1 millimolaire dans le tampon d’arrêt pour créer une solution standard de stock de courbe. Pour chaque 10 échantillons, mélanger 2,17 millilitres de tampon 1x McIlvain avec 100 microlitres du substrat de chitine pour créer une solution de travail, puis pipette 95 microlitres de la solution de travail dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter cinq microlitres de l’échantillon d’essai à chaque puits et le mélanger à la solution de travail.
Couvrez la plaque et secouez-la pendant cinq secondes, puis incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour permettre la réaction enzymatique. Pendant ce temps, diluer la solution stock de 4-méthylumbelliferone pour faire une solution standard de travail de cinq micromolaires et créer une courbe standard en préparant une série de dilutions selon le manuscrit. Commencez par la concentration de cinq micromolaires et mélangez bien chaque dilution.
Après l’incubation, ajouter 200 microlitres de tampon d’arrêt à chaque puits pour arrêter la réaction. Ajouter des doublons de 300 microlitres de chaque norme à la même plaque, puis lire la plaque à une excitation de 360 nanomètres et une émission de 455 nanomètres. Ce protocole a été avec succès employé pour mesurer l’activité de chitinase dans le lavage bronchoalveolar et le fluide de sérum du type sauvage et des souris transgéniques sur-exprimantes de chitotriosidase.
L’analyse confirme que la surexpression du gène CHIT-1 chez la souris entraîne une augmentation de l’activité chitinase. Une courbe standard a été utilisée pour déterminer la chitinase en fonction de la fluorescence des échantillons. La chose la plus importante à retenir lors de la première tentative du protocole est d’ajouter les échantillons aussi rapidement et efficacement que possible tout en mélangeant complètement.
Lorsque vous commencez, il peut être avantageux de faire moins d’échantillons par course pour assurer l’exactitude des mesures, en raison d’une période d’incubation plus courte.
