Este método permite uma maneira mais eficaz de quantificar a atividade da chitinase em amostras biológicas. A atividade de chitinase tem se mostrado como um bom marcador para o diagnóstico e eficácia terapêutica em inúmeras condições e doenças. Os métodos anteriores para a medição da atividade de chitinase eram muitas vezes demorados e difíceis de realizar, ambos os problemas que foram resolvidos pelo ensaio aqui mostrado.
Essa técnica ajudará a cumprir o potencial que as quitinases têm como marcador diagnóstico e terapêutico, facilitando a medição da atividade de chitinase;por exemplo, pode ser usada para monitorar o tratamento da doença de Gaucher, pois a atividade de chitinase tem se mostrado diminuída durante o tratamento eficaz. Comece preparando substratos, padrões e soluções para o ensaio. Prepare 1x tampão McIlvain de acordo com as instruções do manuscrito e use-o para diluir substratos de quittina a 500 micromolar cada.
Dissolver 4-metilumbelliferone, o padrão, a uma concentração de 0,1 milimiliar no buffer de parada para criar uma solução padrão de estoque de curva. Para cada 10 amostras, misture 2,17 mililitros de 1x tampão McIlvain com 100 microlitres do substrato de quitina para criar uma solução de trabalho, depois pipeta 95 microliters da solução de trabalho em cada poço de uma placa de 96 poços. Adicione cinco microliters da amostra de ensaio a cada poço e misture-a na solução de trabalho.
Cubra a placa e agite-a por cinco segundos, depois incubar a placa a 37 graus Celsius por 15 minutos para permitir que a reação enzimática ocorra. Enquanto isso, diluir a solução de estoque de 4-metilumbelliferone para fazer uma solução padrão de trabalho de cinco micromolares e criar uma curva padrão preparando uma série de diluições de acordo com o manuscrito. Comece com a concentração de cinco micromolares e misture bem cada diluição.
Após a incubação, adicione 200 microliters de buffer stop a cada poço para parar a reação. Adicione duplicatas de 300 microliter de cada padrão à mesma placa, em seguida, leia a placa em uma excitação de 360 nanômetros e uma emissão de 455 nanômetros. Este protocolo foi usado com sucesso para medir a atividade de chitinase em lavagem broncoalveolar e fluido soro de tipo selvagem e camundongos transgênicos que expressam demais.
O ensaio confirma que a superexpressão do gene CHIT-1 em camundongos resulta em aumento da atividade de chitinase. Uma curva padrão foi utilizada para determinar a quitinase com base na fluorescência das amostras. A coisa mais importante a ser lembrada ao tentar pela primeira vez o protocolo é adicionar as amostras o mais rápido e eficientemente possível enquanto ainda se mistura minuciosamente.
Quando você começa, pode ser benéfico fazer menos amostras por corrida para garantir a precisão nas medições, devido a um período de incubação mais curto.
