Bu yöntem biyolojik numunelerde kitinaz aktivitesini ölçmek için daha etkili bir yol sağlar. Kitinaz aktivitesi çok sayıda durum ve hastalıklarda tanı ve terapötik etkinlik için iyi bir belirteç olarak hizmet ettiği gösterilmiştir. Kitinaz aktivitesinin ölçümü için daha önceki yöntemler genellikle zaman alıcı ve gerçekleştirmek zor, burada gösterilen tsurça tarafından çözülmüş olan her iki sorun.
Bu teknik, kitinaz aktivitesinin ölçülmesini kolaylaştırarak tanısal ve terapötik belirteç olarak sahip oldukları potansiyel chitinas'ın yerine getirilmesine yardımcı olacaktır;örneğin, etkili tedavi sırasında şitinaz aktivitesinin azaldığı gösterilmiştir, çünkü Gaucher hastalığının tedavisini izlemek için kullanılabilir. Tayiyiz için yüzeyler, standartlar ve çözümler hazırlayarak başlayın. El yazması yönlere göre 1x McIlvain tampon hazırlayın ve her biri 500 mikromolar için chitin yüzeyleri seyreltmek için kullanabilirsiniz.
Standart bir eğri stok çözeltisi oluşturmak için dur tamponunda 0,1 milimolar konsantrasyona 4-methylumbelliferone, standart çözünür. Her 10 örnek için, 2,17 mililitre 1x McIlvain tamponu ile 100 mikrolitre chitin substratını karıştırarak bir çalışma çözümü, ardından 96 kuyulu bir plakanın her kuyunun içine çalışan çözeltinin 95 mikrolitrepipe'ı yerleştirin. Her kuyuya test numunesinin beş mikrolitresini ekleyin ve çalışma çözeltisine karıştırın.
Plakayı kapatın ve beş saniye sallayın, sonra enzimatik reaksiyonun gerçekleşmesini sağlamak için 37 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. Bu arada, beş mikromolar çalışma standart çözüm yapmak ve el yazmasına göre seyreltme bir dizi seyreltme hazırlayarak standart bir eğri oluşturmak için 4-methylumbelliferone stok çözeltisi seyreltmek. Beş mikromolar konsantrasyonu ile başlayın ve iyi her seyreltme karıştırın.
Kuluçkadan sonra, reaksiyonu durdurmak için her kuyuya 200 mikrolitre dur tamponu ekleyin. Aynı plakaya her standart 300 mikrolitre kopyaları ekleyin, sonra 360 nanometre bir uyarma ve 455 nanometre bir emisyon plaka okuyun. Bu protokol bronkoalveoler lavaj ve yabani tip ve chitotriosidaz aşırı ifade transgenik fareler serum sıvısında kitiyolaktiviteölçmek için başarıyla kullanılmıştır.
Taht, farelerde CHIT-1 geninin aşırı ekspresyonunun kitinaz aktivitesinin artmasına neden olduğunu doğrular. Örneklerin floresansına göre konitinazı belirlemek için standart bir eğri kullanılmıştır. Protokolü ilk çalışırken hatırlanması gereken en önemli şey, numuneleri mümkün olduğunca hızlı ve verimli bir şekilde eklerken, tam olarak karıştırmaktır.
İlk başladığınızda, daha kısa kuluçka süresi nedeniyle ölçümlerde doğruluğu sağlamak için her çalıştırma da daha az numune yapmak yararlı olabilir.
