النهج التجريبي لفحص الإشارات الليبتين في الأجسام السباتية وأثارها علي التحكم في التنفس

يمكن استخدام بروتوكولنا لفحص الآثار التنفسية لللبتين على الجسم السباتي في التحكم في التنفس chemoreflex المحيطي ، والاستجابات الفسيولوجية لنقص الأكسجة. يمكننا أيضا تقييم آثار فقدان وكسب وظيفة الجسم السباتي باستخدام جراحية والكيميائية denervation وtransfection الفيروس الغدي على التوالي. قبل البدء في الإجراء ، وقياس درجة الحرارة داخل العرف جعل غرفة البلازماغروفيت الجسم كله ، وقياس الرطوبة النسبية للمختبر.

بعد ذلك، قياس وزن الجسم ودرجة حرارة المستقيم من الماوس التجريبي. ضع الفأر داخل الغرفة ووضع طوق oximeter حول عنق حلق الحيوان. وتأكد من ختم الغرفة تماما لتجنب تسرب الهواء.

انتظر حوالي 30 دقيقة حتى يكون الماوس هادئًا وال chamber هو في حجم ثابت. قبل البدء في تسجيل إشارات الجهاز التنفسي وتشبع الأكسجين المحيطي في normoxia. بعد 20 دقيقة من نورموكسيا، يعرض الحيوان لتدفق الغاز المختلط المستمر من 10٪ من الأكسجين و 3٪ ثاني أكسيد الكربون.

وتبدأ في تسجيل الدورة الأولى من نقص الأكسجة الحادة في إشارات الجهاز التنفسي وتشبع الأكسجين المحيطي. خلال أول 30 ثانية من نقص الأكسجة، فتح اثنين من المنافذ الجانبية الصغيرة في قاعدة الغرفة للسماح في المقابس من الغازات مزيج. بعد ال 30 ثانية الأولى، أغلق أحد المنافذ الجانبية الصغيرة للغرفة وتواصل التسجيل في نقص الأكسجة المستمر عند 10٪ من جزء الأكسجين المستوحاة لمدة خمس دقائق.

في نهاية علاج نقص الأكسجة ، قم بتبديل مصدر التدفق لإعادة تعريض الماوس إلى هواء الغرفة والسماح للحيوان بالتعافي في نورموكسيا لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل بدء التحليل التالي. في نهاية التجربة، قم بتوصيل حقنة في أحد المنافذ الجانبية الصغيرة في قاعدة الغرفة وحقن ملليلتر واحد من هواء الغرفة في غرفة التصوير البلثوغرافي للدم بأكملها ثلاث مرات لمعايرة الغرفة. بعد تدفق الثالثة، وقياس درجة الحرارة في الغرفة مع الحيوان لا يزال داخل والغرفة لا تزال مغلقة.

ثم، افتح الغرفة وقياس درجة حرارة المستقيم من الفأر قبل إعادة الحيوان إلى قفصها المنزل. لإزالة جراحيا من العصب الجيوب الأنفية السباتية، وإدارة المسكنات إلى الماوس التخدير، وإزالة الشعر في منطقة البطن من الرقبة. تطهير الجلد المكشوف مع البيتادين والكحول وتطبيق مرهم على عيون الحيوان.

بعد إجراء شق في منتصف الخط، وإزالة الأنسجة الضامة والشحمية لفضح تشعب الشرايين السباتي المشترك وتحديد العصب hypoglossal. ارفع العصب الهافوغلوزالي لفضح العصب البلعومي السفلي مباشرة واستخدام مقص الربيع الصغير لتشريح الأعصاب الجيبية السباتية بشكل ثنائي. عندما تم الكشف عن الهيئات السباتية، بلطف ميكرولتر واحد من الفيروس الغدي المناسب في أربعة ميكرولترات من مصفوفة ماتريجل السائلة على الجليد، لكل جانب، وتطبيق خمسة ميكرولترات من التعليق الفيروسي لمنطقة الجسم السباتي ثنائيا.

انتظر دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى ترسخت مصفوفة Matrigel السائلة قبل إغلاق الشق مع خياطة حريرية 6-0 وإدارة ملليلتر واحد من تحت الجلد الملحي الطبيعي. ثم منزل الماوس في غرفة الانتعاش مع الرصد حتى إعادة شغل القص قبل إعادة الحيوان إلى قفص المنزل. التسريب المستمر لللبتين يزيد بشكل كبير من استجابة التهوية نقص الأكسجة في الفئران C57BL/6 العجاف في حين أن تشريح العصب الجيوب الأنفية السباتي يلغي هذه الزيادة الناجمة عن اللبتين.

كما هو متوقع ، لا توجد آثار مخففة لتشريح العصب الجيبي السباتي على استجابة التهوية تحت الأكسجة لوحظت في مجموعة الجراحة الصورية بعد ضخ اللبتين. تحريض من اللبتين مستقبلات تعبير isoform طويلة في الهيئات السباتية مستقبلات اللبتين طويلة isoform ناقص بدين db / DB الفئران النتائج في زيادة كبيرة في استجابة التهوية نقص الأكسجة. في حين بعد transfection مع السيطرة لاكز الفيروس الأدينو ، ويلاحظ أي تغيير.

هذه التقنيات تسمح بتحليل دور الهيئات السباتية في chemoreflex المحيطية وآثار اللبتين على الهيئات السباتية في السيطرة على التنفس.